钉螺血蓝蛋白的提取纯化与性质的初步研究

论文摘要

钉螺作为日本血吸虫的唯一中间宿主,它们的分布与血吸虫流行区一致。在钉螺血淋巴中负责氧运输的是一种细胞外的大分子蛋白质—血蓝蛋白（Hc）。目前,有关钉螺血蓝蛋白的研究还未见报道,从分子层面上研究钉螺血兰蛋白,可望为血吸虫防治新技术的研发提供实验依据和理论指导。本文系统研究了钉螺血兰蛋白的提取和纯化方法,并对其结构和性质进行了初步探讨。本实验通过超高速冷冻离心和Sepharose 4B凝胶过滤柱层析法从湖北钉螺血淋巴中提取、纯化了血蓝蛋白。采用紫外吸收光谱法测定了钉螺血蓝蛋白340nm处的特征吸收峰,利用原子吸收光谱法测得其铜含量为0.23%。透射电子显微镜研究结果证实其四级结构为中凹的圆柱体,且以单体、二聚体、多聚体共存于血淋巴中。以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其蛋白质亚基成分,发现有2种蛋白质亚基成分,与蛋白质分子质量标准比较,有-条位置接近400KDa,一条接近250KDa。大量研究事实表明,软体动物及节肢动物的血蓝蛋白与酚氧化酶（PO）虽然功能不同,但在结构上均具有铜氧结合位点,且在特定的条件下,血蓝蛋白又能转化为酚氧化酶样酶（HdPO）而表现出PO活性。实验中利用体外激活剂对钉螺血蓝蛋白的激活结果显示,胰肽酶E和尿素能非常有效地将Hc转化为HdPO,0.1% SDS对Hc的激活作用很弱。为此,本研究中选用2M尿素来激活Hc纯品使之成为HdPO,并以邻苯二酚为特异性底物对其HdPO生物化学性质进行了研究。研究结果表明,HdPO对邻苯二酚底物的最适反应pH值约为7.0和9.0,最适温度约为40℃, Km值约为2.69 mmol/L。底物特异性研究还发现此HdPO不仅对邻苯二酚具有氧化活性,对酪氨酸底物也具有氧化活性,且对酪氨酸的Km值约为9.52mmol/L,说明该酶既具有酪氨酸酶活性,又具有儿茶酚酶活性。此外,HdPO对金属离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）非常敏感,其酶活性能被EDTA强烈抑制,但Ca2+、Mg2+、K+、Na+对酶活性的影响很小。通过ELISA实验确定钉螺血蓝蛋白与日本血吸虫具有共同抗原表位,并对ELISA相关条件进行了优化,为血蓝蛋白的免疫学检测方法奠定了基础。最终确定抗原浓度为50 ng/ml;血清稀释倍数为1:1000;BSA封闭时间为2h;酶标二抗的最佳反应浓度为1:20000,最佳反应时间为1h;底物四甲基联苯胺（TMB）的作用时间为15分钟。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 血蓝蛋白的结构及功能性质研究概述
• 1.1 血蓝蛋白的分离纯化方法研究
• 1.2 血蓝蛋白的光谱性质研究
• 1.3 血蓝蛋白的结构研究
• 1.3.1 节肢动物血蓝蛋白结构
• 1.3.2 软体动物血蓝蛋白结构
• 1.4 血蓝蛋白的功能研究
• 1.4.1 血蓝蛋白降解片段的抗菌活性
• 1.4.2 血蓝蛋白的抗病毒活性
• 1.4.3 血蓝蛋白的酚氧化酶活性
• 1.5 KLH
• 1.6 本论文的研究目的及意义
• 1.7 本论文的主要研究内容
• 第二章 钉螺血蓝蛋白的提取、纯化及结构性质
• 2.1 实验用品
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 实验药品
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 血色素收集
• 2.2.2 血蓝蛋白纯化
• 2.2.3 Sepharose 48 凝胶过滤柱层析
• 2.2.4 蛋白质含量测定
• 2.2.5 SDS-PAGE 电泳法测定血蓝蛋白分子量
• 2.2.6 血蓝蛋白光谱性质测定
• 2.2.7 透射电子显微镜分析
• 2.2.8 N-末端序列测定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 纯化血蓝蛋白
• 2.3.2 纯化血蓝蛋白SDS-PAGE 分析
• 2.3.3 蛋白质含量测定
• 2.3.4 血蓝蛋白光谱性质
• 2.3.5 透射电子显微镜
• 2.3.6 N-端序列
• 2.4 讨论
• 第三章.钉螺血蓝蛋白的酚氧化物酶性质
• 3.1 实验用品
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 实验药品
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 几种激活剂对血蓝蛋白转化为酚氧化酶样酶的激活作用
• 3.2.2 温度对血蓝蛋白酶活性的影响
• 3.2.3 pH 对血蓝蛋白酶活性的影响
• 3.2.4 以邻苯二酚为底物测定血蓝蛋白的Km 值
• 3.2.5 以酪氨酸为底物测定血蓝蛋白的Km 值
• 3.2.6 EDTA 和几种金属离子对血蓝蛋白酚氧化酶活性的影响
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 三种常用激活剂对血蓝蛋白转化为酚氧化酶样酶的激活作用
• 3.3.2 温度对血蓝蛋白酶活性的影响
• 3.3.3 pH 对血蓝蛋白酶活性的影响
• 3.3.4 血蓝蛋白的酶动力学曲线
• 3.3.5 EDTA 和几种金属离子对血蓝蛋白酶活性的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 钉螺血蓝蛋白与日本血吸虫共同抗原的初步研究
• 4.1 实验用品
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验仪器
• 4.1.3 实验试剂
• 4.1.4 溶液配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 抗原包被浓度及单抗最佳使用浓度的测定
• 4.2.2 封闭时间的测定
• 4.2.3 酶标二抗最佳反应浓度的确定
• 4.2.4 酶标二抗的最佳反应时间的确定
• 4.2.5 底物反应时间的确定
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 抗原包被浓度及单抗最佳使用浓度的测定结果
• 4.3.2 封闭时间的测定结果
• 4.3.3 酶标二抗最佳反应浓度的测定结果
• 4.3.4 酶标二抗的最佳反应时间的测定结果
• 4.3.5 底物反应时间的测定结果
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢