论文摘要
细菌生物被膜（bacterial biofilm,BBF）是细菌为适应自然环境,在生长过程中附着于固体表面或破损组织表面而形成的特殊存在形式,是由多细菌组成的膜状结构。生物被膜中的细菌由于被膜的屏障保护作用,能抵御外来攻击,并且能逃避机体的免疫攻击,不易被机体内的抗体溶解和巨噬细胞吞噬,是造成持续感染的主要原因,多数的人类细菌性感染与生物被膜相关。细菌生物被膜广泛存在于自然界中,只要条件允许,任何细菌都可形成生物被膜,其中葡萄球菌是较易形成生物被膜的菌种之一,也是临床中导致难治性感染的主要原因,由于生物被膜的特殊结构及特性,使得生物被膜内的细菌可对抗多数抗生素的杀菌作用,因此,如何清除细菌生物被膜成为近年来的研究热点,早在六、七十年代溶葡球菌酶对葡萄球菌尤其是金葡菌的较强杀菌作用就已得到很多研究人员的重视,本实验首先研究了生物被膜的体外模型建立方法,探讨了各种影响因素对生物被膜形成的影响,在此模型的基础上,研究了重组溶葡球菌酶对葡萄球菌生物被膜的体外清除作用。一、细菌生物被膜体外模型的建立在这部分实验研究中,着重于摸索生物被膜体外模型的建立条件,首先将传统的平板培养法与引导片培养法进行比较,传统的平板培养法以结晶紫染色,测定吸光度值为首选检测方法,最终测得的结果稳定性较差,引导片培养法主要以超声震荡—活菌计数法为定量监测方法,最终所得的结果较稳定,试验重复性较好,在此基础上,以引导片法体外培养生物被膜,比较硅橡胶与玻璃两种不同材质作为黏附载体以及分别使用营养肉汤和TSB肉汤作为培养基时对生物被膜形成的影响,结果显示,以硅橡胶作为黏附载体所形成的生物被膜超声震荡—活菌计数值在几组实验中均高于以玻璃为黏附载体,因此硅橡胶是作为引导片的较好材质,以TSB肉汤作为培养基时所形成的生物被膜超声震荡—活菌计数值在几组实验中均高于以营养肉汤作为培养基时,因此TSB肉汤的营养成分较适宜生物被膜的体外培养,最后以引导片法为生物被膜体外培养方法,硅橡胶作为黏附材质,TSB肉汤为培养基,观察不同时间点和温度对生物被膜形成的影响,并且以超声震荡—活菌计数法为定量监测方法,扫描电镜为定性检测方法,两个监测指标同时反映时间和温度对生物被膜形成的影响,并反映出生物被膜的动态生长过程,结果显示,37℃时生物被膜的生长状态较22℃更好,生物被膜在24hr,48hr,72hr三个时间点呈不断生长的状态,在72hr时间点形成较为成熟的生物被膜。二、重组溶葡球菌酶对葡萄球菌生物被膜的体外清除作用以临床常用的抗金葡菌药物去甲万古霉素作为对照药,研究重组溶葡球菌酶对葡萄球菌生物被膜的体外清除作用,其中一株表葡菌ATCC12228生物被膜形成能力缺陷,作为阴性对照,其他两株金葡菌和一株表葡菌3-26具有形成生物被膜的能力,两药物的作用浓度为MIC～100MIC,对于表葡菌ATCC12228将药物浓度在降低一个等级即1/10MIC～10MIC。分别在2hr,4hr,8hr,24hr四个时间点取出经两药物各浓度作用后两株金葡菌的引导片,以超声震荡—活菌计数法所计得的活菌数反映药物的作用强度,并将重组溶葡球菌酶MIC浓度和去甲万古霉素100MIC浓度作用后的引导片及对照引导片制作电镜样本,送扫描电镜观察;表葡菌3-26仅在24hr时间点取出经两药物各浓度作用后的引导片,再以与两株金葡菌相同的处理方法进行处理;表葡菌ATCC12228的电镜样本为重组溶葡球菌酶MIC浓度和去甲万古霉素MIC浓度作用后的引导片,其他处理过程同表葡菌3-26。重组溶葡球菌酶对两株金葡菌的效果较明显,各药物浓度作用后的活菌计数值随时间点的延长依次下降,MIC浓度作用后的电镜图片与对照电镜图片差别明显,去甲万古霉素对两株金葡菌的效果较差,各药物浓度作用后的活菌计数值无明显波动,100MIC浓度作用后的电镜图片与对照电镜图片相比无明显差别;重组溶葡球菌酶对表葡菌3-26有一定的效果,但不及对金葡菌的效果好,去甲万古霉素对表葡菌3-26依然无明显效果,电镜图片与计数结果相吻合;重组溶葡球菌酶和去甲万古霉素对表葡菌ATCC12228都具有较好的效果,虽然将两药物的浓度降低了一个等级,但计数结果也相应降低,重组溶葡球菌酶的效果略优于去甲万古霉素,电镜结果进一步支持此结果。