子宫内膜癌孕激素耐药机制的研究

论文摘要

子宫内膜癌的发病年龄平均为63岁，其中5—14％的患者发病年龄小于40岁，多合并有未产、不育、月经失调、肥胖及多囊卵巢刺激症，保留生育功能成为这些年轻妇女的迫切需求。孕激素大量、长期应用为子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌保守治疗的主要方法，目前子宫内膜癌的保守治疗对象严格限定于□型子宫内膜癌、临床ⅠA期、组织病理学Ⅰ级、雌、孕激素受体（estrogen receptor ER，progesterone receptor PR）阳性、有良好随访条件、无激素和抗癌药物应用禁忌症、有强烈生育要求的年轻患者。常用的孕激素有甲地孕酮及醋酸甲羟孕酮（medropxyprogesterone acetate MPA）。临床观察表明孕激素保守治疗子宫内膜样腺癌的成功率达到57％—75％，辅以助孕技术可获得一定的妊娠率，对年轻未孕子宫内膜癌患者具有很大的鼓舞性。但并非所有的患者均对孕激素反应良好，或开始反应良好到后来不反应，存在着30％左右治疗失败率。保守治疗失败相应延迟了手术根治的时间，可能会影响病人的预后。探讨孕激素治疗不敏感的机制对于临床保守治疗具有重大的指导意义。本研究利用分化好、雌孕激素受体阳性、对孕激素反应良好的子宫内膜癌Ishikawa细胞，以MPA为诱导剂，采用持续作用、梯度递增的方法诱导孕激素耐药的Ishikawa细胞亚系的建立，探讨雌、孕激素受体表达的改变及TGFa／EGF-EGFR信号通路活性的增强在孕激素耐药发生中的作用，为子宫内膜癌合理、安全、有效的保守治疗提供理论依据。本课题共分三部分：□子宫内膜癌孕激素耐药细胞的建立及其生物学特点；□雌、孕激素受体表达的改变及EGFR信号通路活性增强与孕激素耐药发生的关系；□外源性生长因子TGFa、EGF与子宫内膜癌孕激素耐药发生的关系。第一部分子宫内膜癌孕激素耐药细胞的建立及及其生物学特点目的建立子宫内膜癌孕激素耐药细胞，并研究其生物学特点。方法利用子宫内膜癌Ishikawa细胞，以MPA为诱导剂，采用浓度递增（1-10μM）、持续给药的方法诱导建立子宫内膜癌孕激素耐药细胞；应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法、流式细胞技术（FACS）及Brdu掺入法检测孕激素对母代Ishikawa细胞及孕激素耐药细胞增殖的影响；Transwell小室检测MPA对母代Ishikawa细胞及耐药细胞侵袭能力的影响；RT-PCR技术及Westem-blot技术检测MPA对母代Ishikawa细胞及耐药细胞CyclinD1表达的影响；RT-PCR技术及明胶酶谱技术检测MPA对母代Ishikawa细胞及耐药细胞MMP2、MMP9表达及活性的影响。结果（1）历时10个月MPA诱导后，获得了对MPA耐药的子宫内膜癌Ishikawa细胞亚系，暂且命名为孕激素耐药Ishikawa细胞，简称为耐药细胞。耐药细胞在含10μM MPA的完全培养基中的生长速率与母代Ishikawa细胞在不含MPA的完全培养基中的生长速率基本一致，细胞群体倍增时间分别为34.18±3.15h、35.14±2.68h，差异无统计学意义（t=0.331，P=0.762）。（2）MTT结果表明：MPA抑制母代Ishikawa细胞增殖，抑制效应具有浓度依赖性，不同作用浓度0.1、1、10μM的抑制率分别为20％、28％、41％；与母代Ishikawa细胞相反，相对高浓度的MPA（1.0、10μM）反而促进耐药细胞增殖，促增殖率分别为21％、46％。FACS结果表明：MPA可阻滞母代Ishikawa细胞于G1，阻滞效应具有时间依赖性，MPA作用24、48、72、96h细胞增殖指数分别下降14.2％、18.13％、26％、45％；与母代Ishikawa细胞相反，MPA作用72、96小时明显促进耐药细胞由G1期进入S期，增殖指数分别增加21.9％、20.85％。Brdu掺入实验进一步证实了MPA对母代Ishikawa细胞增殖的抑制作用及对耐药细胞增殖的促进作用。（3）耐药细胞的侵袭能力略高于母代Ishikawa细胞（P＞0.05）。MPA可抑制母代Ishikawa细胞的侵袭能力，MPA作用72h，细胞的侵袭能力下降了64％（t=6.107，P=0.026）；与母代Ishikawa细胞不同，MPA促进耐药细胞的侵袭能力，在MPA的作用下，耐药细胞的侵袭能力增加了26.3％（t=8.660，P=0.013）。（4）MPA抑制母代Ishikawa细胞CyclinD1、MMP2、MMP9的表达并降低MMP2活性，促进耐药细胞CyclinD1、MMP2、MMP9的表达并提高MMP2活性，与对照相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论MPA的长期作用能够导致对孕激素抑制作用敏感的Ishikawa细胞对MPA耐药，一旦耐药发生，MPA可能通过增强CyclinD1、MMP2、MMP9表达及提高MMP2活性促进肿瘤细胞增殖、侵袭能力。提示用孕激素保守治疗子宫内膜癌是可行的，但要警惕长期用药孕激素耐药的发生。第二部分雌、孕激素受体表达的改变及EGFR信号通路活性增强与孕激素耐药发生的关系目的探讨雌、孕激素受体亚型表达的改变及内源性生长因子TGFa及其受体EGFR表达的提高及活性的增强与孕激素耐药发生的关系。方法采用免疫细胞化学、RT-PCR、Western-blot法检测耐药细胞及母代Ishikawa细胞ER、PR亚型的表达及EGFR的表达；RT-PCR检测两株细胞TGFa的表达及MPA对两株细胞TGFa表达的影响；Western-blot检测两株细胞EGFR-TK的表达情况；MTT及流式细胞术检测EGFR-TK抑制剂AG1478对两株细胞增殖的影响；RT-PCR、Western-blot检测AG1478对两株细胞CyclinD1表达的影响；RT-PCR检测AG1478对两株细胞MMP2、MMP9表达的影响。结果（1）与母代Ishikawa细胞相比，耐药细胞ERa、PRB的阳性表达率明显下降，ERβ的阳性表达率增加（均有P＜0.05） （2）耐药细胞TGFa、EGFR的表达水平高于母代Ishikawa细胞（均有P＜0.05），且耐药细胞EGFR自身酪氨酸磷酸化的水平也高于母代Ishikawa细胞。（3）MPA下调母代Ishikawa细胞TGFa表达，上调耐药细胞TGFa表达。（4）MTT结果显示AG1478抑制耐药细胞的增生，抑制作用成浓度依赖性（F=18.148，P=0.00；各用药组与对照相比均有P＜0.05），而较低浓度的AG1478对母代Ishikawa细胞没有明显的抑制作用，高浓度（10μM）的AG1478显示出抑制作用（P=0.009）。细胞周期分析结果表明AG1478可阻滞耐药细胞于G1期，AG1478作用24、48、72h抑制率分别为19.4％、11.2％、10.7％（均有P＜0.05），而对母代Ishikawa细胞细胞周期分布没有明显影响，仅于作用48h显示出阻抑作用（t=5.074，P=0.037），抑制率为9％。细胞侵袭实验结果表明AG1478抑制母代Ishikawa细胞及耐药细胞的侵袭能力，抑制效率分别为42.4％±4.1％及58.1％±6.9％（t=6.083，P=0.026；t=38.105，P=0.001），对耐药细胞侵袭能力的抑制效率要高于母代Ishikawa细胞（t=4.614，P=0.044）。（5）耐药细胞及母代Ishikawa细胞经AG1478作用48h后，CyclinD1、MMP2、MMP9三种基因的表达均下降，在母代IshikaWa细胞中的表达分别下降为原水平的0.767、0.336及0.348倍，在耐药细胞中的表达分别下降为原水平的0.45、0.022、0.148倍。与母代Ishikawa细胞相比，AG1478引起的耐药细胞CyclinD1、MMP2、MMP9表达的下降程度均高于母代Ishikawa细胞（均有P＜0.05）。结论（1）ERa表达的下降，ERβ表达的升高、PRB表达的下降及TGFa-EGFR信号通路活性增强可能参与了子宫内膜癌孕激素耐药的发生。（2）EGFR-TK抑制剂有望成为孕激素耐药子宫内膜癌的一种新型有效的治疗方法。第三部分外源性生长因子TGFa、EGF与子宫内膜癌孕激素耐药发生的关系目的探讨外源性生长因子TGFa／EGF对子宫内膜癌Ishikawa细胞孕激素作用的影响。方法采用MTT法、划痕实验检测TGFa／EGF、MPA及TGFa／EGF联合MPA对母代Ishikawa细胞增殖、迁移运动能力的影响：Western-blot检测TGFa／EGF、MPA及TGFa／EGF联合MPA对母代Ishikawa细胞CyclinD1、E-cadherin蛋白表达的影响；RT-PCR及Western-blot技术检测TGFa／EGF及MPA对母代Ishikawa细胞PRB表达的影响；Western-blot技术检测TGFa／EGF刺激MAPK磷酸化的情况及MPA预作用48h对TGFa／EGF刺激MAPK磷酸化强度的影响。结果（1）TGFa／EGF促进母代Ishikawa细胞的增殖、迁移运动能力，MPA抑制母代Ishikawa细胞的增殖及迁移运动能力，与对照相比差异均有统计学意义（P＜0.05），TGFa／EGF联合MPA促进母代Ishikawa细胞的增殖、迁移运动能力，与单用TGFa、EGF组差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）TGFa、EGF促进细胞周期蛋白CyclinD1的表达，下调E-cadherin的表达，MPA与TGFa、EGF的作用相反，降低CyclinD1的表达，促进E-cadherin的表达，TGFa／EGF联合MPA与TGFa、EGF单独作用的结果相一致，引起CyclinD1表达的上调及E-cadherin表达的下调。（3）TGFa、EGF、MPA均下调PRB的表达，下调作用具有剂量依赖性，小剂量的生长因子TGFa（1ng／ml）、EGF（1ng／ml）、MPA（0.1μM）即能引起PRB表达的下降，随着剂量的增加，下调作用愈明显。TGFa、EGF作用12h，PRB表达下降，24h达到最低点；MPA作用6h，PRB表达开始下降，24h达到最低点，与对照相比差异均有统计学意义（P＜0.05），之后表达又逐渐恢复，但不能恢复至原来水平。（4）TGFa、EGF能激活MAPK的活性分子P-ERK的表达，MPA预作用于母代Ishikawa细胞48h，此时再加入生长因子TGFa／EGF作用5min、15min、30min，P-ERK的表达强度要高于无血清预处理组（不含MPA）。结论（1）外源性生长因子TGFa／EGF促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖、迁移运动能力，拮抗MPA的抑制作用，可能通过上调CyclinD1的表达及下调E-cadherin的表达而发挥作用。（2）MPA抑制子宫内膜癌细胞的增殖及侵袭能力，下调CyclinD1的表达及上调E-cadherin的表达，却不能拮抗生长因子的促进作用及其引起的CyclinD1表达的升高及E-cadherin表达的下降。（3）生长因子TGFa／EGF与MPA都能够下调Ishikawa细胞PRB的表达，降低了细胞对MPA的反应，且MPA的预作用增强了生长因子TGFa／EGF刺激MAPK磷酸化的强度。上述结果提示：MPA的长期作用能够导致对孕激素抑制作用敏感的Ishikawa细胞对MPA耐受，雌孕激素受体亚型表达的失衡及内外源性TGFa／EGF-EGFR信号通路活性的增强可能为子宫内膜癌孕激素耐药发生的机制之一。一旦耐药发生，MPA可能通过增强CyclinD1、MMP2、MMP9表达及提高MMP2活性促进子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭能力。在耐药发生过程中，子宫内膜癌由激素依赖型转为生长因子依赖型。EGFR-TK抑制剂有望成为孕激素耐药的子宫内膜癌新型有效的治疗药物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 子宫内膜癌孕激素耐药细胞的建立及其生物学特点
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 雌、孕激素受体表达的改变及EGFR信号通路活性增强与孕激素耐药发生的关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 外源性生长因子TGFa、EGF与子宫内膜癌孕激素耐药发生的关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 子宫内膜癌孕激素保守治疗现状及其疗效影响因素
• 博士期间发表和待发表的论文
• 致谢