牛朊蛋白3个单氨基酸变异体的原核表达及其包涵体蛋白的变性与复性

论文摘要

【目的】本研究拟以牛朊蛋白正常基因和其含单个氨基酸突变的3 个变异体基因克隆为实验材料,构建牛朊蛋白基因重组表达质粒pGEX-BoPrP（93～241）、pGEX-BoPrP（93～241）（S154N）、pGEX-BoPrP（93～241）（A129V）和pGEX-BoPrP（93～241）（Q234R）及其各原核表达重组菌,以获得4 种有活性的牛重组朊蛋白,进而为牛朊蛋白基因突变与其蛋白结构和性质变化关系的研究提供实验材料。【方法】应用DNA 重组技术,正确地构建牛朊蛋白基因的1 个正常重组朊蛋白和3 个单氨基酸变异体的原核表达载体,经转化E.coli BL21 （DE3）,以获得重组菌E.coli GST-BoPrP （93～241）、GST-BoPrP（93～241）（S154N）、GST-BoPrP（93～241）（A129V）和GST-BoPrP（93～241）（Q234R）,在诱导表达优化条件下诱导各重组菌进行表达,裂菌后对所产生的不溶性包涵体用0.1%温和去污剂Triton X-100 和中低浓度尿素进行洗涤提纯,包涵体提纯物经8 mol/L尿素处理,使其溶解变性后对包涵体裂解产物进行透析复性,并对GST-BoPrP（93～241）（Q234R）复性产物进行GSTrap FF 柱层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting 观察其提纯和复性效果。【结果】成功构建了重组菌E.coli GST-BoPrP（93～241）、GST-BoPrP（93～241）（S154N）、GST-BoPrP（93～241）（A129V）和GST-BoPrP（93～241）（Q234R）,分别可表达预期分子质量约为42.4 ku的与单抗4C11 发生反应的融合蛋白;在37℃以1 mmol/L IPTG诱导表达6 h的优化条件下,各重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30%～45%的目的蛋白;各重组菌诱导表达后所产生的目的蛋白以包涵体的形式存在于菌体内;裂菌后提纯目的包涵体蛋白,经尿素变性处理和透析复性,获得分子质量约为42.4 ku的与单抗4C11 发生反应的融合蛋白,复性产物具有较高纯度;GST-BoPrP（93～241）（Q234R）复性产物经GSTrap FF 柱层析纯化后,可获分子质量约为42.4 ku 的目的蛋白并具有良好的免疫反应性;对比复性产物与纯化产物,发现GSTrap FF 柱层析可除去复性产物中分子质量约为31～40 ku间的杂蛋白,但出现了分子质量约为26 ku的条带,表明GSTrap FF 柱层析可获得高纯度的目的蛋白。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一篇 文献综述 朊蛋白的结构特征及其与朊蛋白基因突变的关系
• 0 前言
• 1 朊蛋白的结构特征
• 1.1 朊蛋白的一级结构与朊蛋白的种属特异性
• 1.1.1 朊蛋白的一级结构
• 1.1.2 朊蛋白的种属特异性
• 1.2 朊蛋白的二级结构特点
• 1.2.1 PrPC的二级结构特征
• 1.2.2 PrPSc的二级结构特点
• 1.2.3 PrPC与PrPSc二级结构及性质的比较
• 1.2.4 朊蛋白的构象转变
• 1.2.5 八肽重复区的二级结构
• 1.2.6 重组PrP的NMR结构
• 1.2.7 不同理化因素对PrP二级结构的影响
• 1.2.8 MoPrP（89～143）的二级结构特征
• 1.3 朊蛋白的三维结构特征
• 1.3.1 成熟的牛朊蛋白球状结构域
• 1.3.2 BoPrP、HuPrP、MoPrP和SHaPrP球状结构域的比较
• 1.3.3 仓鼠和小鼠朊蛋白三维结构的比较
• 1.3.4 大肠杆菌表达朊蛋白的三维结构
• Sc电子结晶学结构'>1.4 PrP^Sc电子结晶学结构
• 1.4.1 PrP27～30的二维晶体
• 1.4.2 糖侧链的测定
• 1.4.3 PrPSc的模型
• 2 朊蛋白的功能及性质
• 2.1 PrPC的功能
• 2.2 朊蛋白的性质与其致病性间的关系
• 2.2.1 糖基化与致病性的关系
• 2.2.2 基因突变与蛋白性质及致病性的关系
• 3 存在的问题与展望
• 第二篇 研究报告 牛朊蛋白3个单氨基酸变异体的原核表达及其包涵体蛋白的变性与复性
• 第一章 牛朊蛋白3个单氨基酸变异体的原核表达
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2 目的DNA片段的PCR扩增与回收
• 2.2.3 pGEX-6p-1质粒DNA和目的DNA片段的酶切与回收
• 2.2.4 重组表达质粒的构建及鉴定
• 2.2.5 重组菌的诱导表达和条件优化
• 2.2.6 表达产物的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 重组PrP表达质粒的鉴定
• 3.2 重组菌诱导表达优化条件
• 3.3 表达产物的检测
• 3.3.1 SDS-PADE分析
• 3.3.2 免疫印迹分析
• 4 讨论
• 第二章 原核表达包涵体蛋白的变性与复性
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.1.4 其他材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 原核表达包涵体蛋白的提取与裂解
• 2.2.2 变性蛋白的复性
• 2.2.3 复性产物的纯化
• 3 结果与分析
• 3.1 重组菌表达目的蛋白及其表达量鉴定
• 3.2 包涵体释放与提纯的鉴定
• 3.3 包涵体裂解物的鉴定
• 3.4 复性产物和纯化产物的鉴定
• 3.4.1 SDS-PAGE鉴定
• 3.4.2 Westernblotting鉴定
• 4 讨论
• 4.1 包涵体蛋白的收集和提纯
• 4.2 包涵体蛋白的变性
• 4.3 变性蛋白的复性
• 4.4 重组融合蛋白的纯化
• 参考文献
• 缩写词英汉对照表
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介
• 独创性声明