microRNA调控植物叶极性的分子机制

论文摘要

microRNA是一类21-24nt的小RNA分子,而双链RNA结合蛋白HYL1则是一个microRNAs形成所必需的蛋白质。HYL1可以与microRNA相结合,在其它microRNAs形成相关蛋白DCL1,AGO1等共同作用下,把前体RNA分子加工为成熟的microRNAs,并介导下游的靶基因的剪切,从而在转录水平上对植物相关基因进行调控。目前的研究发现许多microRNAs参与植物的发育过程。其中, HD-ZIPⅢ基因家族是一个与叶片极性发育相关的基因家族,参与叶片近轴面极性的确定。而miR165/166可以对其进行剪切,在转录后水平上调控这些基因的表达,从而调控植物叶片的极性建立和维持。首先构建了hyl1和rev-6,rev-9,rev-10D和phb-6 phv-5的双突变和三突变体,hyl1叶片呈现向上侧卷的表型,而hyl1 rev-6,hyl1 rev-9,hyl1 phb-6 phv-5叶片平展,恢复为野生型的表型;相对应的hyl1 rev-10D双突变体的叶片比hyl1更加卷曲。说明hyl1叶片的卷曲是由于REV,PHB和PHV等HD-ZIPⅢ家族基因的过量表达引起的,因为HYL1是microRNA成熟过程中一个重要的基因,HYL1的突变导致microRNAs的加工效率降低,从而不能有效的剪切下游HD-ZIPⅢ靶基因。RT-PCR和real-time PCR的表达分析进行进一步的证实了在hyl1中REV,PHB,PHV和CAN的表达都比野生型发生上调。石蜡切片的结果表明,REV,PHB和PHV基因不仅在叶片中具有极性分布,而且调控茎中木质部和韧皮部的空间排布。同时还克隆拟南芥的AGO1 cDNA序列,构建原核表达载体,为下一步研究AGO1与HYL1之间的相互作用,以及它们和叶极性的关系奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 叶片的起始
• 1.1.1 叶原基的固有特性
• 1.1.2 叶原基分生能力的空间调控
• 1.2 叶片的背腹性
• 1.2.1 背腹性的标记
• 1.2.2 拟南芥中 Class III HD–ZIP 基因家族
• 1.2.3 基因表达模式
• 1.2.4 基因功能缺失效应
• 1.2.5 基因功能获得效应
• 1.3 microRNA 与叶发育
• 1.3.1 microRNA 生物合成和功能
• 1.3.2 植物miRNAs 的靶：鉴定和证实
• 1.3.3 调控microRNA 生物合成和功能的 MicroRNAs
• 1.3.4 microRNA 与叶极性
• 1.3.5 microRNA 介导的基因调控
• 1.3.6 microRNA 与表观遗传
• 1.4 展望
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料的种植
• 2.2 叶相关系数的统计
• 2.3 扫描电镜
• 2.4 石蜡切片植物组织观察
• 2.5 CTAB 法植物组织总 DNA 的提取
• 2.6 质粒的提取
• 2.7 热激法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.8 植物组织总 RNA 提取
• 2.9 半定量 RT-PCR
• 2.10 real-time PCR
• 2.11 常规 PCR 体系（TAKARA）
• 2.12 原核表达
• 3 结果
• 3.1 双突变和多突变体筛选
• 3.1.1 hyl1 rev-6 分离比统计和 PCR 鉴定
• 3.1.2 hyl1 rev-9 分离比统计和 PCR 鉴定
• 3.1.3 hyl1 rev-10D 分离比统计和 PCR 鉴定
• 3.1.4 hyl1 phb-6 phv-5 分离比统计和 PCR 鉴定
• 3.2 突变体叶卷曲指数比较
• 3.3 突变体石蜡切片
• 3.4 HD-ZIPⅢ基因 RT-PCR
• 3.5 HD-ZIPⅢ基因real-time PCR 分析
• 3.6 ago1 突变体的表型观察
• 3.7 AtAGO1 基因（cDNA）的克隆
• 3.7.1 PCR 电泳结果
• 3.7.2 阳性克隆的鉴定
• 3.7.3 pMAL 载体的构建
• 3.7.4 拟南芥 AGO1 原核表达
• 4 结论与讨论
• 附图1 目的基因和载体物理图谱
• 附图2 拟南芥 AGO1 cDNA 序列
• 附图3 引物表
• 致 谢
• 参考文献
• 作者简介