小亚璃眼蜱唾液腺cDNA表达文库构建及4D8基因的克隆与原核表达

论文摘要

小亚璃眼蜱（Hyalomma anatolicum anatolicum）是一种重要的外寄生虫,在国内主要分布于新疆自治区的半荒漠草原地区,除可通过叮咬吸血使宿主生产性能降低外,还可作为许多疾病的传播媒介,是制约流行区畜牧业发展、危害居民身体健康的重要因素。本研究采用分子生物学方法构建了小亚璃眼蜱成蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA表达文库,首先从小亚璃眼蜱成蜱半饱血雌蜱唾液腺中提取总RNA,并分离纯化mRNA,采用oligo（dT）引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头,将所产生的cDNA分子用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体的EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切位点之间,体外包装后得到小亚璃眼蜱唾液腺cDNA表达文库。经测定,所构建的表达文库的容量为4.0×105pfu/mL,扩增后的文库库容量为8.8×109pfu/mL,重组率为95%,这说明所构建小亚璃眼蜱唾液腺cDNA表达文库库容量大、重组率高。根据GenBank已公布的边缘革蜱4D8基因序列设计引物,采用PCR技术自小亚璃眼蜱成蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA表达文库中,扩增获得了4D8基因;将其连入到pMD-18-T载体,构建重组克隆载体pMD-18-Hyaa4D8,测序分析表明,克隆的小亚璃眼蜱4D8基因与GenBank上公布的边缘革蜱4D8基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为89.2%和96.0%。然后对重组克隆载体pMD-18-Hyaa4D8进行双酶切,获得带有粘性末端的4D8基因片段,并将此片段定向亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,成功构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Hyaa4D8。将其转化到BL21宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE检测,表达产物为分子量为45 ku的融合蛋白,其表达蛋白浓度为1.24 mg/mL,目的蛋白约占菌体总蛋白的33.0%。采用Western-blotting实验,分析表明此表达产物能被小亚璃眼蜱唾液腺免疫兔血清所识别。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一部分 文献综述
• 1 目的和意义
• 2 蜱的免疫学研究进展
• 2.1 宿主对蜱自然感染的免疫反应
• 2.2 功能性抗原研究现状
• 2.2.1 微小牛蜱的免疫功能性抗原
• 2.2.2 长角血蜱的免疫功能性抗原
• 2.2.3 青海血蜱的免疫功能性抗原
• 2.2.4 小亚璃眼蜱的免疫功能性抗原
• 2.2.5 其它功能抗原的研究
• 2.3 蜱基因工程疫苗的研究现状
• 第二部分 实验部分
• 第一章 小亚璃眼蜱成蜱半饱血雌蜱唾液腺CDNA 表达文库的构建
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 小亚璃眼蜱唾液腺
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 小亚璃眼蜱成蜱半饱血雌蜱唾液腺总RNA 的提取
• 1.1.5 唾液腺mRNA 的纯化
• 1.1.6 唾液腺cDNA 表达文库的构建
• 1.2 结果
• 1.2.1 RNA 和mRNA
• 1.2.2 双链cDNA 检测结果
• 1.2.3 柱层析分级分离大片断cDNA 结果
• 1.2.4 文库库容测定结果
• 1.3 讨论
• 第二章 小亚璃眼蜱4D8 基因的克隆与原核表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 载体和菌株
• 2.1.2 工具酶和生化试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 引物的设计策略
• 2.2.2 引物的设计与合成
• 2.2.3 基因克隆和鉴定
• 2.2.4 表达载体的构建与鉴定
• 2.2.5 重组质粒的诱导表达
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 小亚璃眼蜱4D8 基因的PCR 扩增
• 2.3.2 pMD-18-T-Hyaa4D8 重组质粒的鉴定
• 2.3.3 重组表达质粒pGEX-4T-1-Hyaa4D8 的酶切鉴定以及PCR 鉴定
• 2.3.4 重组质粒的测序鉴定及序列分析
• 2.3.5 4D8 基因的表达产物SDS-PAGE 结果
• 2.3.6 蛋白质的纯化及SDS-PAGE 结果
• 2.3.7 表达产物的Western-blotting
• 2.4 讨论
• 第三章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 导师简介