一、眼镜王蛇(OPhiophagus hannah)毒中L-氨基酸氧化酶的分离纯化和理化性质的研究（论文文献综述）
王博[1]（2021）在《我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选》文中研究指明第一部分我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析海蛇属蛇目眼镜蛇科海蛇亚科,全球共70余种,我国分布有17种,优势种为平颏海蛇（Hydrophis curtus,H.curtus）和青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus,H.cyanocinctus）,在北部湾及海南、福建近海最为多见。海蛇毒是由多种蛋白、多肽和小分子物质共同组成的混合物,其主要组分为神经毒素和多种酶类,致死性极强。由于海蛇种类、地域分布及猎食对象的不同,海蛇毒中所含的蛋白种类和占比也有一定差异。为了更好地研究我国海域平颏海蛇毒（H.curtus venom,Hcu V）和青环海蛇毒（H.cyanocinctus venom,Hcy V）的组成,比较分析两者差异情况,本部分以平颏海蛇和青环海蛇为研究对象,首先构建了海蛇毒腺转录组数据库;其次利用液相色谱-质谱联用技术,通过蛋白组学方法对两种海蛇毒的蛋白组成进行了比较分析;在组学基础之上,我们又进一步对海蛇毒相关的生物学性质进行了测定与分析。主要结果如下:1.首先应用Illumina Hi Seq?平台对我国两种海蛇毒腺进行了转录组测序,成功构建了高质量的毒腺转录组数据库,平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别获得38,710和35,716条unigenes序列。我们将毒腺的转录组数据在公共数据库（NR、KEGG、GO、KOG、Swiss Prot）中进行了功能注释,在NR数据库中,两种海蛇毒腺注释序列来源最多的3个物种均为Notechis scutatus,Pseudonaja textilis,Ophiophagus hannah;在KEGG注释中,平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别注释了10,949和10,683条unigenes,主要集中在信号转导和疾病发生相关的路径中;对简单重复序列（simple sequence repeats,SSR）位点检测,平颏海蛇和青环海蛇毒腺转录组中分别发现了15,171和12,908个SSR位点,其中以单核苷酸为重复单元的类型占比最高,均超过了50%。通过与Uni Prot动物毒素库（Uni Prot animal toxin and venom database）Blast比对,在两种海蛇毒腺中总共筛选到了17种蛇毒蛋白,充分挖掘了海蛇毒腺中蛇毒蛋白功能基因的资源。2.通过液相色谱-质谱联用技术,获得Hcu V和Hcy V蛋白组分的原始肽段,匹配检索Uni Prot动物毒素数据库,在Hcu V和Hcy V中分别鉴定到47和38种毒素相关蛋白。根据功能分类,鉴定到的毒素相关蛋白可归为15个家族,主要包括:三指毒素、蛋白酶类、磷脂酶类、富含半胱氨酸毒素蛋白类、毒素因子、离子通道抑制剂等。这些毒素多见于蛇类,但也有少数见于其它有毒生物,包括蜘蛛（Lycosa singoriensis）、蝎子（Lychas mucronatus）、芋螺（Conus textile）等。3.通过毒素蛋白组比较分析发现,不同毒素家族在Hcu V和Hcy V中所占比例不同,具体的蛋白组成也有一定差异。Hcu V和Hcy V中比例最高的两类毒素均为三指毒素（主要包括短链和长链神经毒素）和磷脂酶A2,在Hcu V中所占比例分别为54%和38%,在Hcy V中分别为69%和22%,与文献报道的不同海域海蛇毒的组成及占比有明显差异。两种海蛇毒的生物学活性测定结果表明,Hcu V和Hcy V的小鼠半数致死量(LD50)分别为0.34 mg/kg和0.24 mg/kg,都有很强的致死性;两种海蛇毒均检测到明显的神经毒性、磷脂酶A2活性,以及微弱的蛋白酶活性和间接溶血毒性,但无明显的促凝与抗凝活性,这些活性检测结果与组学分析结果相一致。本部分通过对Hcu V和Hcy V进行多组学分析,并结合蛇毒生物学活性检测,揭示了我国两种优势种海蛇毒组成的分子多样性,也提示毒素蛋白组成比例的不同与其咬伤症状表现和致死效应之间可能存在的关系,为后续研制针对我国海域海蛇咬伤中毒的抗毒血清提供了重要基础。第二部分抗平颏海蛇毒血清的制备及其抗毒效果评价海蛇毒主要组分为神经毒素,能阻断神经突触传递,从而产生一系列中毒症状。海蛇毒的毒性极强,可诱发严重的呼吸衰竭,死亡率高,目前针对海蛇咬伤最有效的急救方式是尽快注射抗毒血清,但我国仅生产几种抗陆地蛇毒血清,对海蛇咬伤救治效果不佳。第一部分研究结果提示,不同海域、不同种类的海蛇,其毒素组成存在一定差异,因此有必要研制特异性针对我国海域优势种海蛇毒的抗毒血清,本论文第二部分即以我国海域优势种平颏海蛇毒为抗原,经过抗原处理、免疫马匹、抗体纯化等步骤,制备了高效价的抗毒血清;并进一步对抗海蛇毒血清的体内外抗毒效果进行了评价,明确了抗毒血清的有效用量和使用时机,为今后临床应用提供了参考。主要结果如下:1.采用0.6%甲醛浓度灭活毒素再添加弗氏不完全佐剂进行乳化,使毒素抗原获得最大的免疫原性,免疫马匹后50天采血可获得最高效价的马血清;经过酶消化、硫酸铵沉淀、超滤、柱层析等抗体纯化步骤后,抗海蛇毒血清中抗体F（ab’）2蛋白纯度达到91.6%,杂质大量减少,同时具备较好的毒素中和能力。2.抗平颏海蛇毒血清（H.curtus antivenom,Hcu AV）体外抗毒实验结果显示,Hcu AV对平颏海蛇毒和青环海蛇毒均有良好中和效果:1 m L Hcu AV能够对抗1.2 mg平颏海蛇毒或0.9 mg青环海蛇毒,使半数实验动物存活,提示Hcu AV能交叉中和多种海蛇毒,并为体内实验的抗毒血清用量提供了依据。3.Hcu AV体内抗毒实验结果显示,海蛇咬伤中毒后注射Hcu AV能显着提高实验动物的存活率,但需在短时间内（出现中毒症状前）尽早注射足量抗毒血清才能达到较好的救治效果,预防用药和延迟用药均无法降低中毒死亡率。同时,Hcu AV能有效减轻海蛇毒造成的多器官病理学变化。本部分以平颏海蛇毒为抗原,制备了高效价、高纯度的抗平颏海蛇毒马血清,能有效中和Hcu V和Hcy V,覆盖我国海域优势种海蛇毒。海蛇咬伤后尽快注射足量抗毒血清,能显着地降低中毒死亡率,保护机体脏器免受损伤,为今后抗海蛇毒血清的临床应用提供了实验依据。第三部分平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析海蛇毒由多种酶类、非酶类蛋白和多肽、小分子物质组成,是一类重要的海洋生物毒素。海蛇毒除了剧烈的毒性之外,也含有多种结构特异、功能新颖的活性物质,具有多样的药理学效应如:镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗血栓等。海蛇毒中的活性物质是海洋生物资源开发研究的热点之一。本部分以我国南海海域平颏海蛇为研究对象,分离其毒腺组织,利用M13噬菌体展示技术构建了平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库。然后以内毒素LPS为靶标分子,经过多轮淘选,筛选出一个高亲和力的噬菌体克隆,通过基因测序、氨基酸序列预测与性质分析等,最终通过化学合成法获得了一段功能性多肽,并通过体内、体外实验评价其对内毒素的拮抗效果。本部分主要结果如下:1.构建了高质量的平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库,文库库容达到2.2×109,随机测序验证外源插入片段准确无误;c-Myc标签检测结果表明,外源插入片段在噬菌体外壳表面得到了高效的展示。2.以LPS为靶标分子,经过4轮固相淘选、阳性克隆测序、氨基酸序列预测等过程,获得了一段平颏海蛇毒腺来源的21肽。多肽性质分析结果表明,该多肽富含碱性氨基酸,理论分子量为2523.15,理论等电点为10.76,在中性溶液中携带正电荷;该多肽的二级结构主要为α-螺旋,氨基与羧基端呈现出双亲性结构,能够与带负电荷疏水性的LPS特异性结合。3.通过化学合成方式成功合成并纯化了该21肽,纯度超过95%,质谱测定实际分子量与软件预测的理论值相符,证明合成的多肽无误,可用于进一步实验。利用生物膜干涉技术（BLI）对该多肽与LPS的结合力进行测定,结果表明,该多肽与LPS具有较强的结合能力,结合方式为“快结合-慢解离”。内毒素中和实验表明,该海蛇毒腺来源的21肽具有明确的内毒素中和效果,因而将其命名为H.curtus Endotoxin-neutralizing Peptide,简称Hc-ENP。4.体外实验结果表明,Hc-ENP具有明确的LPS拮抗效果,在5-10μg/m L浓度下,能够有效抑制LPS与RAW264.7细胞的结合。Western-blot、ELISA、细胞免疫荧光等结果显示,Hc-ENP能通过抑制MAPK、NF-κB炎性信号通路的激活,从而有效抑制LPS刺激细胞产生的一系列炎性反应,包括:炎性因子释放、炎性相关酶表达量升高、活性氧含量增加等,进而发挥抗炎活性。5.体内实验结果表明,Hc-ENP能够有效抑制LPS刺激机体引发的全身性炎性反应,包括:靶器官炎性细胞浸润、血清炎性因子水平升高、器官组织中炎性相关酶表达量升高、组织病理改变等。本部分通过构建高质量海蛇毒腺M13噬菌体展示库来进行淘选,从而获得平颏海蛇毒腺中的特定活性分子。本实验中我们获得了一个平颏海蛇毒腺来源的内毒素中和肽—Hc-ENP,其在体内外均有明确的LPS拮抗效果,本研究为进一步开发利用海蛇基因资源,探索其开发应用价值提供了新的途径。
李安[2]（2021）在《青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN10的靶点拮抗机制及基于三代测序的青环海蛇多组学研究》文中研究指明研究背景:海洋中蕴藏着丰富的生物资源,其巨大的生物多样性和独特的生态环境使海洋生物成为新药发现的重要来源,这其中包括一类栖息在沿岸浅海中的剧毒眼镜蛇类——海蛇。青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus）是我国主要的优势蛇种之一,药用价值极高,被《本草纲目》等多部药典收集入药,具有祛风燥湿,通络活血和滋补强壮等功效。现代研究表明,青环海蛇蛇毒及组织中含有抗炎抗风湿、抗菌、抗肿瘤和镇痛等作用的多种蛋白和活性多肽成分,但具体的活性分子单体及其靶点和作用机制并不明晰。我们课题组前期通过构建青环海蛇毒腺噬菌体展示文库建立了以人TNF-α（肿瘤坏死因子α）及其受体TNFRs为靶标的抗炎活性分子筛选平台,并以TNFR1为靶点获得了22肽Hydrostatin-SN1。SN1在体内外具有一定的抗炎活性,但由于它与TNFR1和TNFR2都能结合,对靶点的选择性不强而可能带来副作用,其成药性并不高。为了提高多肽对TNFR1的选择性,我们通过序列截短及筛选实验获得了十肽Hydrostatin-SN10。SN10在体外能够专一性结合TNFR1,选择性地拮抗TNF-TNFR1的相互作用,对DSS和OXZ诱导的小鼠急性结肠炎模型有着显着的抗炎治疗效果,并表现出了良好的药代动力学性质,无明显毒性。与目前临床上治疗IBD（炎症性肠病）的主要药物TNF单克隆抗体等大分子制剂相比,SN10能够在封闭TNFR1传递的促炎有害信号的同时,保留与TNFR2有关的促进细胞增值修复和炎症抑制的信号通路,减少毒副作用,因此SN10具有良好的靶点选择性、体内外抗炎活性和安全性,有望开发成为治疗IBD等TNF-α相关疾病的海洋来源多肽类创新药。然而,SN10是否在体内水平也对TNFR1有选择性尚没有得到验证。同时,SN10对靶点TNFR1的选择性机制、拮抗方式及结合位点也不明确,这些都阻碍了对SN10抗炎分子机制的深入理解以及SN10的进一步结构优化与改造。除了Hydrostatin-SN10之外,我们前期基于靶点TNF-α/TNFRs从青环海蛇毒腺噬菌体展示文库中又筛选出了多种抗炎活性小肽,而这些多肽在数据库中未发现与之同源且功能类似的序列,说明青环海蛇中存在独特的抗炎活性肽,且有潜力发展成为抗炎药物候选分子。我们期待从青环海蛇中找到更多的生物活性肽,但是遇到了两大瓶颈问题:一是基于噬菌体展示技术的生物淘选方法存在假阳性高、筛选时间跨度长、文库覆盖面限于转录组水平等缺点;二是海蛇样本采集困难,蛇毒活性成分富集几乎没有可能,且如果大量采集海洋生物样本可能会破坏海洋生态平衡,尤其是青环海蛇已被列为国家二级保护动物。近些年来生物技术的飞速发展使高通量测序的成本和周期大大减少,陆续出现了第二代测序（NGS）、第三代测序（TGS）及染色体构象捕捉（Hi-C）等先进的测序技术。已有越来越多的药用海洋生物的多组学信息被测序,给海洋药物研发带来了很大的推动。由于蛇毒中的活性成分大都为分子量较小的蛋白/多肽,而全基因组信息中包含了全部蛋白/多肽的编码基因序列,包括在蛇毒中丰度很低但可能具有独特药理活性的蛋白/多肽,这为基于序列信息从多组学大数据中系统挖掘潜在的生物活性肽提供了可能。然而,目前青环海蛇尚没有全基因组序列报道,而其他海蛇类的基因组研究多基于二代测序技术,组装的质量较差,极大影响了活性分子发现的完整性。因此,我们亟待通过三代测序及Hi-C等技术获得青环海蛇高质量的全基因组、转录组、蛋白组等多组学数据,来对其中的生物活性肽进行系统、高效、精准的挖掘。研究目的:本课题首先将通过基因敲除动物模型确证多肽Hydrostatin-SN10在体内水平对靶点TNFR1的专一选择性;分析SN10与TNFR1的相互作用及结合位点,并利用体内外活性实验对多肽上的关键氨基酸位点进行验证,以此来全面深入地揭示SN10对靶点TNFR1的拮抗机制,并指导SN10进一步的结构优化改造。另一方面,联合三代测序、二代测序和Hi-C技术,获得药用海洋生物青环海蛇的高质量全基因组,毒腺转录组和毒液蛋白质组,注释得到青环海蛇全部的基因和蛋白质序列,并鉴定出所有的毒素相关基因,从而建立青环海蛇高质量的多组学数据库和完善的毒素组学数据库,为高通量、系统地、精准地挖掘青环海蛇来源的新型生物活性肽提供大数据支持。研究方法:一、青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN10拮抗靶点TNFR1的机制探究与验证1、通过DSS（葡聚糖硫酸钠）诱导分别建立野生型、Tnfr1和Tnfr2基因敲除小鼠的急性结肠炎模型,从小鼠疾病活动指数、体重、结肠长度、脾重指数、炎症因子表达、结肠组织病理改变以及TNF-TNFRs下游NF-κB和MAPKs信号通路的变化几个方面的指标来观察并比较SN10在不同基因型小鼠中的抗炎治疗效果,从而判断SN10在体内水平对TNFR1是否具有选择性。2、使用Rosetta软件构建多肽SN10的三维结构模型,并利用Upside和Gromacs软件进行分子动力学模拟,获得SN10的主要结构。3、利用Zdock软件将多肽SN10与TNFR1胞外区蛋白（PDB号:1NCF）进行分子对接,并通过Gromacs进行分子动力学模拟,得到TNFR1-SN10复合物结构模型;使用Discovery Studio软件分析结构模型中SN10与TNFR1的结合界面和相互作用氨基酸,对SN10上可能的结合位点进行丙氨酸突变,合成突变肽。4、利用MST（微量热泳动）技术检测并比较SN10及其突变肽与TNFR1的亲和力,观察各突变肽的体外活性与SN10相比是否有显着的下降。5、构建LPS（脂多糖）诱导的小鼠急性休克模型,使用SN10及各突变肽进行腹腔注射治疗（800μg/kg）,观察各组小鼠的生存率,比较各突变肽的体内活性与SN10相比是否有显着的下降。二、青环海蛇的多组学测序与组装1、基因组二代测序与基因组勘测:提取海蛇肌肉组织中的基因组DNA,构建350 bp插入片段大小的文库,在Illumina Hi Seq X Ten平台上进行双端测序。原始数据经质控后进行K-mer分析,预估基因组的大小、杂合度和重复度。2、基因组三代测序:构建青环海蛇肌肉组织的基因组20 Kb大片段SMRTbell文库,在Pac Bio Sequel平台上测序10～11个SMRT Cell。3、Hi-C测序:构建肌肉组织的Hi-C测序文库（300-500 bp）,经质控合格后,用Illumina Hi Seq X Ten测序仪进行双端测序,对原始数据进行过滤处理得到高质量的clean reads。4、基因组组装与质量评估:根据基因组勘测分析结果,利用Falcon和Falcon-Unzip等软件对Pac Bio三代数据进行预组装,得到contig水平的组装结果。然后利用三代数据对基因组进行一轮纠错。之后,通过Hi-C辅助基因组组装,构建染色体水平的scaffolds,并将Pac Bio三代数据回比Hi-C组装的基因组,填补基因组中存在的gap区域。最后,利用三代数据进行一轮纠错,再利用二代数据进行两轮纠错,得到最终的组装版本。利用BUSCO分别对青环海蛇和其他代表性蛇类基因组的完整度进行评估并比较。5、三代全长转录组测序:提取海蛇毒腺组织的总RNA,构建10 Kb的三代全长转录组SMRTbell测序文库,在Pac Bio Sequel测序平台上测序1个SMRT Cell。对原始数据进行质控分析后得到高质量的Isoform序列,然后利用二代数据进行校正,最后通过聚类得到Unigene序列。6、二代转录组测序:分别提取3条海蛇的毒腺组织总RNA,使用Oligo（d T）富集的方法构建二代测序文库,使用Illumina Hi Seq X Ten测序仪进行双端测序。原始数据经质控后,利用Trinity软件对转录本进行从头拼接,根据序列相似性以及长度,挑选出最长的一条作为Unigene。7、毒液蛋白质组:提取毒液样品中的总蛋白,取一部分进行蛋白浓度测定和SDS-PAGE检测,另取一部分进行胰酶酶解及TMT标记,然后将各标记样品等量混合后进行反相液相色谱分离,最后对样品进行LC-MS/MS检测及肽段数据分析。三、青环海蛇多组学的生物信息学分析1、基因组注释:首先采用EDTA流程对重复序列进行预测。之后采用MAKER流程,调用BRAKER、Augustus和Gene Mark-ES等多种软件,分别基于同源预测和从头预测的证据对编码基因进行多轮的结构注释。将结构注释得到的所有蛋白序列比对到NR、Swiss-Prot、KEGG、GO等功能数据库,筛选具有最高序列相似性的蛋白,从而得到功能注释信息。2、基因家族聚类:通过Ortho Finder流程将近缘物种的蛋白序列基于序列相似性进行聚类。3、系统进化分析:对各个单拷贝直系同源基因家族内的基因分别进行多序列比对,将比对结果合并连接后,使用软件RAx ML通过最大似然法构建进化树,并进行物种分歧时间的估算。4、基因家族扩张与收缩分析:使用软件CAFE模拟进化树上每个谱系的基因家族扩张和收缩事件。对于发生扩张和收缩的基因,进行GO和KEGG pathway功能富集分析,并用超几何分布检验的方法计算每个条目中扩张/收缩基因富集的显着性。5、正选择分析:根据基因家族聚类的结果,对每个共有单拷贝直系同源基因家族,使用codeml程序通过支位点特异模型及卡方检验分析受到正选择的基因,并进行功能富集分析。6、基因组共线性分析:对青环海蛇和草原响尾蛇所有基因最长转录本的CDS序列进行比对得到直系同源基因对,然后通过MCScan X软件获得共线性区块。利用Python软件包JCVI展现共线性结果。7、毒素相关基因的鉴定:将青环海蛇基因组注释出的所有蛋白序列通过BLASTp比对到已知的毒素相关蛋白库中。比对结果去冗余后,将属于同一个基因的蛋白（protein isoforms）合并。然后利用Swiss-Prot的注释信息对这些基因进行进一步分析,确定毒素基因和毒液蛋白基因。8、毒素相关基因的表达:将毒腺RNA-Seq的clean reads比对到注释过的青环海蛇基因组上,获取落到每个样本中每个基因上的reads数目,然后采用FPKM算法来计算基因的表达量。9、毒素相关蛋白的表达:对毒液蛋白组鉴定出的肽段,利用基因组注释出的蛋白数据库进行检索,并筛选可信蛋白。然后根据毒素相关基因的注释结果,进一步分析毒素相关蛋白在毒液中的表达。研究结果:一、青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN10拮抗靶点TNFR1的机制探究与验证1、在各基因型小鼠中构建DSS诱导的急性结肠炎模型并给予SN10治疗,结果显示:在Tnfr2-/-小鼠中,SN10治疗组在疾病活动指数、体重、结肠长度、脾重指数、炎症因子表达、结肠组织病理学改变以及TNF-TNFRs下游炎症相关信号通路的磷酸化激活这些指标上,与模型组相比都有明显的改善（p<0.05）,其治疗效果与在野生型小鼠中相当;而在Tnfr1-/-小鼠中,SN10对这些指标都没有明显的缓解作用。2、通过分子对接及分子动力学模拟,获得了四种TNFR1-SN10复合物的结构模型,分析SN10上与TNFR1结合的可能位点有D1、E2、E8、L9、H10。其中Model1为最优的模型,在Model 1中,SN10结合到了TNFR1的CRD2和CRD3结构域,SN10的E8位点与TNFR1的R77和N110位点分别形成了静电相互作用和氢键。3、MST测定SN10及各突变肽与TNFR1的亲和力结果表明,M1（E8A）的体外活性有较显着的变化,其亲和力KD值（>>171μM）较SN10（2.75μM）下降了62倍以上。4、在LPS诱导的小鼠急性休克模型中,突变肽M1体内活性的变化最显着,使用M1治疗后小鼠的生存率（12.5%）较SN10治疗组（87.5%）下降了75%（p<0.01）。二、青环海蛇的多组学测序与组装1、通过基因组三代测序、二代测序和Hi-C测序,我们获得了1.98 Gb的青环海蛇全基因组,组装出了18条染色体（7条大染色体和11条小染色体）。组装质量评估结果显示,青环海蛇基因组的contig N50为18.99 Mb,scaffold N50为264.25 Mb,gap比例0.01%,BUSCO完整度90.1%。各项指标与已发表蛇类基因组相比,青环海蛇基因组的组装质量是最高的,并且与其他基于二代测序的海蛇类基因组相比,基因组的连续性提升明显（>100倍）。2、通过三代全长转录组测序获得了青环海蛇毒腺的全长转录本18117条,最大长度12.1 Kb;通过二代转录组测序及拼接获得毒腺转录本54344条。3、通过TMT标记定量蛋白质组分析获得了青环海蛇毒液蛋白肽段序列7709条。三、青环海蛇多组学的生物信息学分析1、青环海蛇基因组注释得到了23898个基因,编码43062个蛋白（转录本）。2、重复序列的分析结果表明,青环海蛇基因组在进化过程发生了LTR反转录转座子的明显扩张。3、系统发生分析表明,青环海蛇与平颏海蛇及陆生眼镜蛇类的亲缘关系很近。真海蛇类约在1990万年前从陆生眼镜蛇类进化而来,而青环海蛇这一独立物种约在950万年前出现。4、基因（家族）进化分析表明,青环海蛇基因组中有907个基因家族发生了扩张,1565个基因家族发生了收缩,这些基因主要与犁鼻器-嗅觉受体系统,盐离子跨膜转运,听觉、视觉感知,能量代谢及固有免疫应答等功能相关;有80个基因受到了正选择,这些基因主要与DNA错配修复,m RNA可变剪接,呼吸链,氧气感知等功能有关。5、通过基因组共线性分析,鉴定出了青环海蛇的第5号染色体为性染色体Z。6、在青环海蛇基因组中鉴定出了来自35个毒素相关家族的241个毒素相关基因,其中包括60个毒素基因。代表性的毒素相关家族有3FTx（三指毒素）,PLA2（磷脂酶A2）,CRISP（富含半胱氨酸的分泌蛋白）,v Kun（Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂）,v CTL（C型凝集素）,SVMP（蛇毒金属蛋白酶）。其中3FTx的毒素基因拷贝数最多（20个）,包括5个LNTX（长链神经毒素）基因和9个SNTX（短链神经毒素）基因。同时,从中发现了一些编码潜在药用活性分子的基因,包括CATH（抗菌肽）、NGF-β（神经生长因子-β）及PLI-γ（磷脂酶A2抑制剂-γ）等。7、通过对毒腺转录组和毒液蛋白组进行表达定量分析发现,青环海蛇蛇毒中表达量最高的两种毒素为3FTx和PLA2。在毒腺转录组中,123个毒素相关基因呈显着表达,其中3FTx表达量占毒素相关转录本的45%,且LNTX比例（30.8%）较SNTX（14.1%）高;PLA2转录本占39%。毒液蛋白组中鉴定到了毒素相关蛋白69个,包括毒素蛋白24个,其中3FTx家族检测到了3种LNTX毒素和1种SNTX毒素。结论:本研究首先确证了青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN10在体内水平对靶点TNFR1具有专一选择性。进一步探究SN10对靶点TNFR1的拮抗机制发现,SN10很可能是通过E8（第8位氨基酸谷氨酸）占据TNF-α与TNFR1结合的关键位点,直接竞争性拮抗TNFR1与TNF-α的结合,从而抑制TNFR1-TNF复合物的形成及下游信号的激活。这对SN10的进一步结构优化改造,以及从海洋生物中筛选类似的专一靶点的先导活性肽具有重要的指导作用。另一方面,我们获得了药用海洋生物青环海蛇的高质量染色体水平全基因组,毒腺的全长转录组以及毒液的蛋白质组,建立了具有完善注释的青环海蛇多组学数据库和毒素组学数据库,为高通量、精准挖掘青环海蛇来源的新型生物活性肽提供大数据支持;同时,对海蛇等海洋珍稀濒危品种生物资源的保护利用和海洋创新药物的研发也具有重要意义。
刘锦花[3]（2018）在《中华眼镜蛇蛇（Naja atra）毒中的两种重要成分（氨肽酶和PLA2）的分离纯化及其性质研究》文中研究说明毒蛇咬伤（俗称蛇伤）被WHO规定为一种被忽视的热带疾病,其多发于热带或亚热带的贫困山村。蛇伤中毒常常给蛇伤患者带来身体损害、经济负担和心理恐慌后遗症等。蛇伤急救之首要前提是搞清蛇毒的组成成分及其致毒病理分子机制。研究表明,总体上看,蛇毒是一种复杂的混合物,含有多种酶、蛋白质、活性小肽及无机物等,因毒蛇种类不同其毒素成分有差异,依据毒性可以分为神经毒蛇毒、血循毒蛇毒以及混合毒蛇毒,其主要作用于蛇伤患者的神经、血液和肌肉系统,给他们带来在心血管系统、神经系统或肌肉系统等方面的损伤或紊乱。因此搞清蛇毒的组成成分及其功能对于蛇伤的急救是非常重要的。中华眼镜蛇（Naja atra）是我国引发蛇伤高发的毒蛇种类之一,其毒液主要为神经毒与血液毒的混合类型,尽管对该蛇毒的研究报道较多,但对该蛇毒的全貌成分的构成仍然缺乏系统研究,尤其是氨肽酶成分研究缺乏。当前,还未有从中华眼镜蛇毒中鉴定出氨肽酶的报道,为此,本研究首次主要针对该蛇毒中的氨肽酶成分进行分离鉴定,拟鉴定出该酶;同时,由于蛇毒中存在多种类型的磷脂酶A2（PLA2）亚型,故对该蛇毒中的PLA2进行分离纯化与鉴定研究也有一定的意义。这些研究为弄清该毒蛇引发蛇伤致毒致病的分子机制奠定基础。我们通过系列实验后,现将获取的结果,归纳整理如下:一,通过咬皿法采取新鲜毒液,经低温冻干后,将中华眼镜蛇毒进行HiTrap-Sepharos Fast Flow阳离子交换层析后,再将有氨肽酶活性的峰进行Amastatin-AH Sepharose 4B亲和层析,最终得到有氨肽酶活性的组分,该组分通过还原性SDS-PAGE分析鉴定,其呈现单一条带,其分子量约为150 kD,利用BCA蛋白法,测得纯化后最终所得目的蛋白浓度1.4 mg/ml。二,通过该氨肽酶组分的活性与性质实验表明:在研究pH值对氨肽酶活性的影响实验表明,该氨肽酶在反应体系的pH为8.5时,分解底物时活性最强;温度影响实验表明,该氨肽酶发生水解谷氨酸对硝基酰苯胺酸（Glu-pNA）的最适温度为35℃金属离子影响实验表明,有的金属离子(如Ba2+、Ca2+、Sr2+等)可明显增加氨肽酶水解Glu-pNA的活性,有金属离子(如Ni2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+以及Cd2+)则明显抑制氨肽酶水解Glu-pNA的活性,且当它们的离子浓度达到1 mM时,可完全抑制该氨肽酶水解Glu-pNA的活性;选用五种人工合成的底物Asp-pNA、Leu-pNA、Glu-pNA、Arg-pNA和Ala-pNA进行该氨肽酶组分的水解活性测试,结果表明,这五种底物中,Glu-pNA是最适的底物;通过中华眼睛蛇毒免疫鸡,从鸡蛋中获得抗蛇毒IgY抗体与该氨肽酶反应,实验表明,该氨肽酶组分与该IgY无明显中和效应,该结果提示该氨肽酶组分在中华眼镜蛇毒中的含量非常低,无法在该蛇毒免疫鸡时导致抗该氨肽酶组分的抗体产生。三,通过两步法,即Hi Trap-Sepharos Fast Flow阳离子交换层析和HPLC层析,从中华眼镜蛇毒中分离得到具有PLA2活性的组分,该组分通过SDS-PAGE鉴定为单一条带,其分子量大约为17 kD;该组分经HPLC分析呈单一峰。这些结果提示我们分离纯化得到的具有PLA2活性的组分为单一组分。四,采用磷脂酶活性检测法,测试该组分的酶活性以及温度、pH、金属离子对该酶活性的影响,实验表明,随pH升高,该酶水解鸡卵黄底物活性增强,且当pH为10左右时,水解活性最强;该酶水解鸡卵黄底物的最适温度为37℃。K+、Na+、Ca2+能增加PLA2的酶活性,而Zn2+、Fe2+能则抑制该酶的活性。五,我们通过用中华眼镜蛇毒免疫鸡,从鸡蛋中获得抗蛇毒的Ig Y抗体。把从该蛇毒中分离纯化PLA2组分分别与该Ig Y抗体进行中和能力实验,实验表明,PLA2组分与该Ig Y抗体有中和效应出现,并呈现量效关系,其ED50为4.568μg。结果提示,该蛇毒的PLA2组分含量较高,能在免疫鸡时产生抗PLA2组分的抗体。总之,本研究从中华眼镜蛇毒中获得两个重要组分氨肽酶和PLA2,并初步分析测试了它们的酶活力和部分性质,同时也初步评估了在该蛇毒免疫鸡时所产生的抗蛇毒Ig Y对这两个组分的中和能力,这些结果为制备抗蛇毒抗体和为进一步弄清该蛇毒致伤的分子机制提供了基础。但该两个组分的氨基酸序列和结构有待下一步研究。
胡玲玲[4]（2017）在《银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定》文中指出以蛇入药治疗多种疾病在我国已有相当悠久的历史。银环蛇（Bungarus multicinctus）俗称金钱白花蛇,隶属于脊索动物门、爬行纲、有鳞目、眼镜蛇科、环蛇属。中医学认为金钱白花蛇味甘、咸,性温、有毒,具有祛风、通络、定惊、止痒、止痉的功能。蛇毒是毒蛇的毒腺分泌的毒液,作为一类天然的动物毒素蛋白,其含有多种酶类蛋白、非酶蛋白和其他小分子物质,并具有广泛的生物学活性和药理作用,最明显的特征就是具有极强的毒性。银环蛇蛇毒含有多种活性成分,是复杂的混合物,主要以神经毒素为主。中医历来有“以毒攻毒”的治疗法则,研究表明蛇毒中含有纤溶、促凝、镇痛、抗癌等方面的药理功能成分,具有降压、镇痛、消炎和抗肿瘤作用。目前为止,蛇毒液中的某些活性成分经过修饰和改造已被制成成品药,用于临床上疾病的治疗。近年来,随着高通量测序技术和生物信息学分析技术的发展以及日益成熟,越来越多的科研人员将研究重点转移到动物药中多肽物质的研究与开发上来,动物药成为寻找与开发天然活性药物的源泉。因此,探究银环蛇蛇毒的成分以及其发挥药理作用的活性物质具有极其重要的理论和现实意义。本研究利用Illumia HiseqTM2500技术构建且分析银环蛇的转录组文库。使用Trinity拼接软件对所得到的序列进行De novo拼接,最终共获得63,947条高质量的 Unigene（>200bp）,总长度为 64,485,567 bp,其中最长 Unigene 为 23,902 bp,最短为200 bp,平均长度为1008 bp,N50为1806 bp。通过Blastx搜索五大数据库进行基因功能注释,共有21,900条（34.25%）Unigene在NR数据库中存在着相似序列。在NR库注释中筛选出与毒素有关的Unigene,显示银环蛇蛇毒富含神经毒素。同时,分别有17,987条（28.13%）、13,963条（21.84%）、6981条（10.92%）、15,964 条（24.96%）Unigene 在 SWISSPROT、KOG、KEGG和GO数据库中注释成功。结果表明,构建的银环蛇转录组文库质量较高,筛选获得的毒素相关Unigene为银环蛇功能基因的分子克隆、蛇的药用价值研究奠定了基础。采用三步层析纯化法,即凝胶过滤层析、凝胶过滤层析和阴离子交换层析,从银环蛇粗毒中分离纯化得到一种新的L-氨基酸氧化酶,并命名为Bm-LAAO,每500 mg银环蛇蛇毒中纯化得到4.40 mg的LAAO,约占蛇毒总蛋白质含量的0.88%。纯化得到的Bm-LAAO的总活力为297.81 U,酶的比活力为67.70 U/mg,通过RP-HPLC技术和SDS-PAGE均证实其为均一蛋白。通过肽质量指纹图谱分析发现,本研究分离得到的银环蛇LAAO的蛋白序列与NCBI数据库中银环蛇LAAO的cDNA序列高度相符合。Bm-LAAO是一种糖基化的黄素蛋白酶,在还原条件下,其表观分子质量约为62.5 KDa。大部分的蛇毒LAAO在37℃左右活性最高,然而,Bm-LAAO的反应最适温度为45℃,最适pH分别为8.4。酶动力学研究表明,此酶对疏水性L-氨基酸具有较高的催化活性,且不能催化D-氨基酸的氧化脱氨反应,最好的底物基质是L-Met、L-Leu、L-Phe。研究发现去糖基化的Bm-LAAO的酶活力下降了 54.3%,说明糖基化对银环蛇的酶活性有较大的影响。储存温度同样对Bm-LAAO也很重要,相对而言,-80℃是最佳的储存温度。利用PCR技术,本研究从提取的银环蛇毒腺总RNA中克隆出了Bm-LAAO的cDNA序列,该序列编码一条由496个氨基酸残基组成的成熟肽。并采用蛋白质的同源建模技术,以哈里氏蝮蛇毒LAAO的晶体结构作为模板,预测Bm-LAAO的三维结构。本研究利用抑制肿瘤细胞增殖作用的体外实验对Bm-LAAO的抗肿瘤活性进行测定,采用MTT法测定其对肿瘤细胞和人正常细胞增殖能力的影响,采用显微镜及流式细胞仪观察和检测Bm-LAAO对肿瘤细胞的细胞凋亡作用的影响。在所检测的11种肿瘤细胞株中,Bm-LAAO对人胃癌细胞MGC-803具有最强的增殖抑制活性,其IC50为314 ng/ml;对三种人乳腺癌细胞BT474、MDA-MB-231、MCF-7的IC50分别为378、1213、1480 ng/ml,而对正常人乳腺细胞MCF-10A的IC50为13,556 ng/ml,分别是上述三种人乳腺癌细胞的35.86倍、11.18倍和9.16倍。研究表明,相对于正常细胞,Bm-LAAO对肿瘤细胞具有较强的选择性和细胞毒性。当过氧化氢酶及Bm-LAAO共同作用肿瘤细胞时,细胞活性恢复了 75%,表明在很大程度上,Bm-LAAO对细胞的增殖抑制活性可能是LAAO催化过程中产生的H2O2所致。流式细胞仪分析结果显示Bm-LAAO可以诱导MGC-803和MCF-7细胞凋亡,且呈现剂量依赖性的方式,而过氧化氢酶Catalase可以很大程度上减弱Bm-LAAO诱导的细胞凋亡作用,提示Bm-LAAO诱导的细胞凋亡作用也可能与H2O2的产生有关。综上所述,本研究构建并分析了银环蛇的转录组文库,且克隆得到了Bm-LAAO的基因序列;从银环蛇粗毒中分离纯化得到了 LAAO,并对其体外抗肿瘤作用和诱导细胞凋亡作用的机制进行了初步的研究,这为进一步深入地探讨其作用机制和可能的实际应用奠定了基础。
杨玉娥[5]（2016）在《中介蝮毒素组学研究：聚焦丝氨酸蛋白酶家族》文中认为蛇毒中含有许多有用组分,近年来,质谱技术和高通量测序技术的不断发展加快了对蛇毒组分的剖析进程。和传统的技术相比,最新的测序平台可以对更多的蛇毒组分进行分析。蛇毒腺的高通量测序可以从mRNA水平了解样品中所转录的基因,除了获得毒素蛋白质,也能够检测出非酶毒素成分的信息。基于串联质谱法的蛇毒蛋白质组学研究依赖于已有蛋白质序列数据库的信息量,但可从另一个侧面验证高通量测序的结果,二者互为补充,将两者结合起来从全局的角度探索蛇毒素蛋白具有重大意义。中介蝮（Gloydius intermedius）属于蝰科（Viperidae）蝮亚科（Crotalinae）亚洲蝮属（Gloydius）,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种,广泛分布于我国西北及华北地区。为了了解中介蝮的毒素全貌,本研究采用IlluminaHiseq2500高通量测序技术结合LC-MS/MS技术对中介蝮毒腺转录组和蛋白组进行了分析。主要结果如下:1、中介蝮毒腺转录组分析（1）利用BlastX程序将中介蝮毒腺转录组组装得到的19821条Unigene对NR蛋白数据库进行搜索,10547个Unigene得到功能注释,其中编码毒素蛋白的Unigene有27个,分别归属为10个毒素家族,金属蛋白酶（MP）6个,磷脂酶A2（PLA2）6个,蛇毒C型凝集素样蛋白（CTLP）4个,丝氨酸蛋白酶（SP）3个,三指毒素（3FTx）3个,透明质酸酶（Hydase）、磷酸二酯酶（PDE）、富含半胱氨酸的分泌蛋白（CRISP）、L-氨基酸氧化酶（L-AAO）以及神经生长因子（NGF）各1个。（2）按照RPKM值所揭示的表达丰度,毒素表达水平从高到低的排序依次为:PLA2 家族（82435.79）>SP 家族（30758.48）>CTLP 家族（6562.87）>L-AAO 家族（6347.89）>NGF 家族（4857.31）>CRISP 家族（1204.57）>MP 家族（1020.96）。其余低表达的毒素包括 PDE 家族（191.29）>Hydase 家族（148.39）>3-FTx 家族（27.93）。（3）对新获得的9个Gisps基因的序列进行的氨基酸序列分析表明,Gisp1和Gisp3属于激肽原酶（Kininogennase,KN）型丝氨酸蛋白酶;Gisp2属于蛋白酶C激活剂（C-protein activator,PCA）型;Gisp4 和 Gisp5 属于凝结酶（Cogulating enzymes,CL）型;Gi-PA1-4 属于纤溶酶原激活剂（plasminogen activators,PA）型。（4）实时定量PCR分析表明,中介蝮9个Gisps的相对表达量由高到底依次为:Gisp1>Gi-PA1>Gisp2>Gi-PA2>Gisp3>Gi-PA3>Gisp4>Gi-PA4>Gisp5。2、中介蝮毒素蛋白组分析采用LC-MS/MS技术对中介蝮粗毒样品进行鉴定,结果表明共有1146条肽段匹配到10个毒素家族,即510,356,192,27,26,12,12,7,2,2条肽段分别匹配到SP,LAAO,PLA2,MP,CTLP,CRISP,BPP-CNP,PDE,Hydase和NGF等毒素家族。值得注意的是,未发现PLB和3-FTx家族的肽段。比较转录组和蛋白组分析结果,可以看出SP、LAAO和PLA2是表达量最高的3个毒素家族。3、中介蝮丝氨酸蛋白酶的分离纯化及活性测定由于丝氨酸蛋白酶是中介蝮毒素中表达量较高的家族之一,该家族在医药领域有广泛的应用,尤其是在心血管疾病治疗方面。本研究在上述组学研究的基础上,通过凝胶过滤层析及阴离子交换层析对其粗毒进行了分离纯化,得到丝氨酸蛋白酶组分,利用特定底物对其活性分析进行了测定,利用SDS-PAGE分析了丝氨酸蛋白酶在每个组分中的含量,结果如下:（1）利用凝胶过滤层析介质Sephacryl-200HR对中介蝮粗毒进行了分离得到6个组份,用小分子合成多肽底物BApNA检测丝氨酸蛋白酶活性,发现丝氨酸蛋白酶活性主要分布在P3组分,该组分为混合物,需要做进一步分离。（2）利用阴离子交换层析介质HiTrap DEAE FF对P3组分进行了进一步分离得到5个蛋白组份（P3-1～P3-5）。以4个合成发色肽（B7632、T1637、B2133、V7127）为底物检测发现:分离得到的5个组分（P3-1～3-5）的类激肽释放酶活性都比较低;P3-1和P3-2都显示出较高的凝血酶活性及类凝血酶活性,而纤溶酶活性及类激肽释放酶活性较低;P3-3具有较高的纤溶酶活性及凝血酶活性;对5个组分中丝氨酸蛋白酶所在位置（26kDa～35kDa）的分析意外的发现:P3-1和P3-2中丝氨酸蛋白酶相对含量较高但丝氨酸蛋白酶活性较低,而P3-3中丝氨酸蛋白酶含量相对较低,但是丝氨酸蛋白酶活性较高;P3-4和P3-5对四种底物都没有明显的水解活性。表明P3-4和P3-5中几乎不含有丝氨酸蛋白酶。结合对9种Gisps的理化性质的预测结果,推测 Gisp3、Gisp4、Gisp5 分布在 P3-1 中,Gisp1 分布于 P3-2 中,Gi-PA1、Gi-PA2、Gi-PA3 分组在 P3-3 中,Gi-PA4 分布于 P3-1 或 P3-2 当中。结论:（1）在亚洲蝮属的6个物种中,中介蝮毒素中表达的PLA2神经毒素最高,而其他大多数亚洲蝮主要含有出血性的毒素。和响尾蛇类似,本研究在亚洲蝮毒素中发现了毒素进化的二态现象。同时还发现亚洲蝮毒素中存在神经毒素与降血压组分（如KN-type SP和BPP-CNP）的共进化趋势。（2）在中介蝮蛇毒中只存在P-ⅢMP而没有P-Ⅰ和P-ⅡMP.获得了 9个丝氨酸蛋白酶家族成员。Gisp1和Gisp3为KN型,Gisp2为PCA型,Gisp4和Gisp5为CL型,Gi-PA1-4属于PA型丝氨酸蛋白酶。（3）除CRISP和Hydase,大部分中介蝮毒素的氨基酸序列与其他蝮蛇或者响尾蛇有高度的相似性（>90%）。蛇毒素的快速进化主要表现在一些关键毒素家族的表达水平差异以及新型毒素蛋白,而不是影响编码序列的点突变。
余志良,周宁,乔华[6]（2012）在《L-氨基酸氧化酶的研究进展》文中进行了进一步梳理L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase,LAAO）能特异性催化L-氨基酸氧化脱氨,生成α-酮酸、氨和H2O2。该酶分布较广,其中蛇毒源LAAO是该类酶中研究最为深入的一类,近年来,越来越多的非蛇毒源LAAO被发现和报道,现对蛇毒源和非蛇毒源LAAO的研究进展进行了综述。现有研究表明,不同物种来源的LAAO,其底物选择性、等电点、稳定性等理化性质不尽相同;虽对其结构的研究还较少,但现有的研究表明蛇毒源和非蛇毒源LAAO的结构都含有FAD结合结构域、底物结构域和螺旋结构域;研究已发现不同来源的LAAO体外具有多种不同的生物学功能,而这些生物学功能多数是由于其产物H2O2作用的结果;对LAAO异源表达的研究较少且都不甚成功,可能是由于其需要进行翻译后修饰。
郭春梅[7]（2011）在《白眉蝮蛇蛇毒L-氨基酸氧化酶的表征》文中研究说明蛇毒（SV）是由多种生物活性多肽、蛋白质、核苷、胺和金属离子等组成的复杂混合物。L-氨基酸氧化酶（LAAOs）作为蛇毒中的一个重要成分,有着多样的生物学活性,其通过催化氧化L-氨基酸产生过氧化氢（H2O2）赋予蛇毒一定的毒性。目前,从蛇毒中分离得到的LAAOs以数十计,大量研究结果表明,蛇毒L-氨基酸氧化酶（SV-LAAOs）可以诱导或抑制血小板聚集、刺激水肿形成、诱导出血或溶血,具有抗凝活性、细胞毒性、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓、抗菌消炎、抗利什曼原虫、诱导细胞凋亡和抗HIV活性等多种生理作用。SV-LAAOs是一个新的毒性蛇毒蛋白群,是非常有趣的一类活性物质,具有潜在的药物开发价值和临床应用前景。采用离子交换、凝胶过滤层析及高效液相色谱层析从长白山白眉蝮蛇（Agkistrodon blomhoffii Ussurensis）蛇毒中纯化了一种L-氨基酸氧化酶,命名为Akbu-LAAO。Akbu-LAAO在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上显示单一泳带,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF mass spectrometry）表征结果:Akbu-LAAO是由两个相同亚基组成的分子量约为124.4 kDa的二聚体。Akbu-LAAO经胰蛋白酶胶内酶解,产生的肽段经高效液相色谱-电喷雾串联质谱（HPLC- nESI-MS/MS）进行序列分析,蛋白鉴定采用TurboSequest Bioworks软件完成,质谱鉴定得到了10个肽段序列:VVEELKR、YPVKPSEEGK、KFWEDEGIHGGK、VTVVYQTPAK、HDDIFAYEK、IKFEPPLPPK、SAGQLYEESLGK、FDEIVGGMDK、RFDEIVDGMDK、FDEIV DGMDKLPTAM#YR。Akbu-LAAO与来源于蛇毒Calloselasma rhodost, Agkistrodon halys, Daboia russellii siamensis和Trimeresurus stejnegeri的LAAOs的氨基酸序列有同源性,但比对分析表明Akbu-LAAO是一种新的蛇毒LAAO。采用辣根过氧化物酶偶联法,以L-亮氨酸（L-Leu）为酶的反应底物,发现Akbu-LAAO水解活性的最适pH为4.7;在溶液pH为4.7时,Akbu-LAAO催化L-Leu反应的Km值为2.1 mM。电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）检测结果表明每个Akbu-LAAO分子中含有4个Zn2+,Zn2+的存在并不影响Akbu-LAAO的水解活性,但是Zn2+的去除却使Akbu-LAAO的最大荧光发射峰的强度降低61%,这说明Zn2+对Akbu-LAAO的水解活性不是必需的,但有助于维持酶结构完整性。外源金属离子Mg2、Mn2+、Ca2+、Ce3+、Nd3+、Co2+和Tb3+可以增加Akbu-LAAO对L-Leu的水解活性,另外,Ni2+、La3+和Gd3+轻微地降低了Akbu-LAAO水解L-Leu的活性,Fe2+、Cu2+和Eu2+/Eu3+对其水解活性影响不大。我们发现Akbu-LAAO对人和兔血小板的聚集有一定抑制及解聚作用,但抑制作用有显着差别,以动物血小板代替人血小板进行类似实验有一定风险,结果表明Akbu-LAAO在治疗心血管疾病方面将起到一定的作用。Akbu-LAAO能够显着抑制金黄色葡萄球菌生长,是相同条件下头孢类药物剂效的18倍,可作为潜在的抑菌剂使用。总之,本论文采用四步层析纯化方法从长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离得到了一种新的天然的LAAO,具有一定潜在的药物开发价值和临床应用前景。对Akbu-LAAO的生物化学、酶学性质、结构和生物活性的表征,为Akbu-LAAO的进一步开发和应用奠定了一定基础。
张秉怡[8]（2010）在《白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分离纯化及理化性质研究》文中认为白眉蝮蛇（Agkistrodon blomhoffii Ussurensis）属于蝰蛇科蝮蛇亚科,是我国剧毒蛇类之一,在国内广泛分布河北、甘肃、上海、辽宁、台湾等省市,在国外朝鲜半岛也有分布。白眉蝮蛇毒已作为生产溶血栓药物“蛇毒溶栓酶”的主要原料,但蛇毒中其他活性组分的分离纯化、生物学特性及其经济价值还未得到全面深入研究。5’-核苷酸酶（5’-nucleotidase）是催化核苷酸分子中的磷酸键水解的一种特异性水解磷酸酶。5’-核苷酸酶能特异地水解5’-核苷酸酶和5’-脱氧核苷酸酶连接戊糖的5’-磷酸,生成对应的核苷或脱氧核苷和无机磷酸。5’-核苷酸酶是一种常规分子生物学酶试剂,因其活性的变化与很多疾病密切相关,还可以用作许多疾病的诊断对照试剂,比如：肝胆疾病、冠心病、肺癌、消化道肿瘤、甲亢、骨病、喉癌等。5’-核苷酸酶广泛分布于细菌、植物细胞和蛇毒毒液中。1951年Hepple首次从蛇毒中分离纯化出5’-核苷酸酶。至今为止已发现二十八种蛇毒5’-核苷酸酶,但尚未有白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶相关研究报道。建立白眉蝮蛇毒5’-核苷酸酶的分离纯化方法,并对其理化性质进行研究,将为白眉蝮蛇毒的深入开发、积累5’-核苷酸酶基础数据等方面都具有重要意义。本论文采用离子交换DEAE Sephadex A-25柱层析、凝胶过滤SephadexG-75柱层析,从白眉蝮蛇蛇毒分离纯化得到了一个5’-核苷酸酶。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE）鉴定了其纯度并计算了其分子量,测定了其比活、最适pH、温度等理化性质,考察了常见金属离子对其活性的影响,还观察了简单糖对其活性的保护作用以及其对ADP诱导的血小板聚集过程的影响。经SDS-PAGE此5’-核苷酸酶分子量为70kDa,用高碘酸硝酸银阿利辛蓝染色法鉴定白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶为糖蛋白。白眉蝮蛇蛇毒5，-核苷酸酶的最适温度为55℃,最适pH为pH 9.0。以AMP为底物测得纯化所得酶蛋白的5，-核苷酸酶活力为562.44U。从目前的实验结果看来,此5’-核苷酸酶对热稳定酶,耐碱性环境。Cu2+、Fe3+浓度范围为（0.05 mmol/L.0.3mmol/L）能抑制白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性,Fe3+强烈抑制白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性。Mg2+、Ca2+、K+浓度范围为（0.05 mmol/L.0.3mmol/L）均能促进白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性,其中Ca2+促进效果更好。低溶度（0.05 mmol/L.0.25mmol/L）β-巯基乙醇对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性有一定促进作用。低浓度（0.05mmol/L.0.25mmol/L）EDTA对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性有促进作用,而0.3 mmol/L EDTA对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶有明显抑制作用。可能是因为低溶度EDTA能作为金属螯合剂先与抑制白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶的金属离子结合比如Cu2+、Fe3+,随着EDTA溶度增加与促进白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶金属离子结合比如Mg2+、、Ca2+、K+等。导致白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶活性降低。本文还研究了单糖和双糖对酶蛋白的保护作用,实验中采用了葡萄糖、果糖、海藻糖、蔗糖四种。经测定,葡萄糖、果糖、海藻糖对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶均具有一定的保护作用。糖对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶保护作用从未有发现,具体机制尚待研究。白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶对血小板聚集有诱导作用,促进ADP诱导的血小板聚集。白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶可以作为血小板聚集的诱导剂。值得注意的是,这一实验现象与目前文献报道其他蛇毒5’-核苷酸酶活性相反。其机制还待进一步深入探讨。
吕秋敏,赖仞,张云[9]（2010）在《动物毒素与人类疾病——从单一成分到组学研究,从理化性质到疾病机理,从粗毒利用到理性药物设计》文中指出为了适应环境,很多动物在长期的进化过程中演化出了丰富的毒素及相关分泌物。这些物质中包含了高活性、作用专一的蛋白和多肽。由于它们作用的特异性和专一性,成为蛋白质多肽结构与功能研究的良好模型,也成为研究人类自身生理病理机制的工具和线索,同时也是开发临床诊断试剂和治疗药物的天然宝库。该文综述了中国科学院昆明动物研究所30多年来立足于我国丰富的有毒动物资源,对陆生有毒动物,包括蛇毒、两栖类皮肤分泌物及节肢动物唾液腺分泌物等的主要研究工作,总结了从单一成分到组学研究、从理化性质到人类疾病机理、从粗毒利用到理性药物设计等的发展历程,并对今后的研究提出一些建议。
黄剑钧[10]（2009）在《舟山眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的分离纯化及对体内外抗血管生成作用》文中提出L-氨基酸氧化酶（EC1.4.3.2）是一类以FAD为辅基的黄素蛋白酶,能立体特异性催化L-氨基酸氧化脱氨生成α-酮酸、H2O2和氨[1]。L-氨基酸氧化酶在蛇毒中分布非常广泛,是蛇毒中一种重要的组分,并有众多的生物学活性如:诱导或抑制血小板聚集、细胞毒性、抗菌活性、抗肿瘤作用等。蛇毒中的酶虽然不是蛇毒的主要毒性成分,但它与蛇伤后引起的出血肿胀、组织坏死、伤口溃烂等有密切的关系。近来一些研究表明,蛇毒中的L-氨基酸氧化酶能够诱导细胞凋亡,还能影响血小板功能,被蛇特别是眼镜蛇和蝮蛇咬伤后伤口血流不止等提示L-氨基酸氧化酶可能诱导血管内皮细胞凋亡,对新生血管的生长有一定的影响。本课题通过优化舟山眼镜蛇毒的L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase of Naja atra venom,NAV-LAO）的酶活性测定方法、分离纯化,观察NAV-LAO对人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）的增殖影响、体外小管形成及鸡胚尿囊膜新生血管生成等的影响,为蛇毒L-氨基酸氧化酶的进一步研发提供实验依据。1. NAV-LAO活性测定方法优化采用邻联茴香胺（ODA）、邻苯二胺（OPD）和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）三种供氢体测定NAV-LAO的活性并比较它们灵敏度和重复性。OPD方法的灵敏度在浓度1.0-0.0025mg·ml-1范围内显着高于其他两种方法（p<0.05或p<0.01）,且其RSD为2.1%说明其重复性较好。2. NAV-LAO的分离纯化及部分理化性质测定眼镜蛇毒粗毒经过SP-Sepharose FF阳离子交换色谱,获得13个蛋白质组分。采用OPD检测方法,对各洗脱峰进行L-氨基酸氧化酶活性测定,发现组分Ⅰ具有L-氨基酸氧化酶活性,收集含有L-氨基酸氧化酶活性的组分。将Ⅰ组分过Heparin Sepharose CL-6B肝素亲和层析色谱纯化得到一个NAV-LAO纯品。NAV-LAO经12%SDS-PAGE电泳为一条清晰的蛋白带,在SDS-PAGE凝胶电泳中,不论是还原还是非还原其电泳均为一条带,说明NA-LAO为单链蛋白,相对分子质量约58 kD。3. NAV-LAO对人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）细胞生长的影响采用MTT法观察NAV-LAO对人脐静脉内皮细胞株HUVEC细胞增殖的抑制作用。结果显示NAV-LAO呈剂量依赖性的抑制细胞的生长,NAV-LAO作用24h对于HUVEC细胞的IC50为21.42μg/ml。4 NAV-LAO对HUVEC细胞移动能力的影响划痕实验检测NAV-LAO对HUVEC细胞迁移能力的影响。在原始致伤区的基础上,与未用药组比较,实验组细胞的运动能力明显下降,与对照组相比有显着性差异（P <0.01）。5. NAV-LAO对HUVEC细胞体外小管形成的影响采用小管形成实验观察NAV-LAO对内皮细胞的抗血管生成作用,通过比较管腔形成个数、面积、周长,发现NAV-LAO抑制HUVEC细胞管腔形成,并且这种作用呈剂量依赖关系。6. Hoechst33342观察NAV-LAO对HUVEC细胞凋亡的影响NAV-LAO作用HUVEC细胞后,经Hoechst33342核荧光染色,发现药物作用后凋亡细胞显着多于对照组,并且发生凋亡的细胞体积缩小,胞核浓缩、靠边、深染,并可见凋亡小体。7. NAV-LAO对HUVEC细胞caspase3、caspase8表达量的影响Western Blotting分析不同浓度NAV-LAO处理HUVEC细胞24h后,caspase3、caspase8的表达量的变化。结果发现caspase3、caspase8表达量均较对照组增加,且呈一定的剂量相关性。8. NAV-LAO对鸡胚尿囊膜（Chick Chorioallantoic membrane,CAM）血管生成的影响选用鸡胚尿囊膜模型观察NAV-LAO对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用,采用测量区血管面积与测量区面积的比值（VA/CAM）评价抑制程度。结果显示的NAV-LAO组（μg）处理后可见鸡胚CAM血管形态基本正常,呈树状分布,但分布稀疏,与PBS组相比VA/CAM显着减少（P﹤0.01）。其中PBS组VA/CAM（%）为45.75±7.12,而NAV-LAO3.2μg、6.5μg、12.9μg,其VA/CAM（%）分别为32.35±3.83,23.66±2.72,18.48±2.29;阳性对照组Dex75μg VA/CAM（%）为17.43±2.52,通过以上数据显示,NAV-LAO在低浓度就具有抑制血管生成作用。结论:采用OPD方法检测L-氨基酸氧化酶具有较高的灵敏度和重复性。通过两步层析从舟山眼镜蛇毒中分离得到一个L-氨基酸氧化酶纯品NAV-LAO,分子量为58KD。通过体内外实验发现NAV-LAO具有抗血管生成作用。
二、眼镜王蛇(OPhiophagus hannah)毒中L-氨基酸氧化酶的分离纯化和理化性质的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、眼镜王蛇(OPhiophagus hannah)毒中L-氨基酸氧化酶的分离纯化和理化性质的研究（论文提纲范文）
（1）我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 抗平颏海蛇毒血清的制备及抗毒效果评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 蛇毒中活性组分的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（2）青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN10的靶点拮抗机制及基于三代测序的青环海蛇多组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN10 拮抗靶点TNFR1 的机制探究与验证 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、Hydrostatin-SN10 体内靶点选择性的验证 |
| 三、Hydrostatin-SN10与TNFR1 的相互作用分析 |
| 四、Hydrostatin-SN10与TNFR1 结合位点的验证 |
| 实验结果 |
| 一、Hydrostatin-SN10 的体内靶点选择性 |
| 二、Hydrostatin-SN10与TNFR1 分子相互作用的模拟 |
| 三、Hydrostatin-SN10与TNFR1 结合位点的验证 |
| 讨论与小结 |
| 第二章 青环海蛇的多组学测序与组装 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、青环海蛇全基因组测序与从头组装 |
| 三、青环海蛇毒腺转录组测序与拼接 |
| 四、青环海蛇毒液蛋白质组的检测 |
| 实验结果 |
| 一、青环海蛇全基因组测序与组装 |
| 二、青环海蛇毒腺转录组测序与拼接 |
| 三、青环海蛇毒液蛋白质组 |
| 讨论与小结 |
| 第三章 青环海蛇多组学的生物信息学分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 一、软件与数据库资源 |
| 二、青环海蛇基因组注释 |
| 三、比较基因组学分析 |
| 四、毒素相关分析 |
| 分析结果 |
| 一、青环海蛇基因组注释 |
| 二、比较基因组学分析 |
| 三、毒素相关分析 |
| 讨论与小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 蛇毒及其多组学的研究进展 |
| 参考文献 |
| 发表论文和工作情况 |
| 致谢 |
（3）中华眼镜蛇蛇（Naja atra）毒中的两种重要成分（氨肽酶和PLA2）的分离纯化及其性质研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景、目的与意义 |
| 1.2 本研究的主要内容 |
| 1.2.1 中华眼镜蛇粗毒的制备 |
| 1.2.2 中华眼镜蛇粗毒的生物活性检测 |
| 1.2.3 蛇毒中氨肽酶的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究 |
| 1.2.4 蛇毒中PLA_2的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究 |
| 1.3 本研究技术路线 |
| 2 中华眼镜蛇粗毒的制备及其活性的测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器与设备 |
| 2.1.2 材料与试剂 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.1.4 中华眼镜蛇粗毒的制备 |
| 2.1.5 中华眼镜蛇粗毒活性的检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 中华眼镜蛇蛇毒中蛋白含量 |
| 2.2.2 中华眼镜蛇蛇毒LD50的测定 |
| 2.2.3 氨肽酶和PLA_2活性检测 |
| 2.3 讨论 |
| 3 中华眼镜蛇毒中氨肽酶的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要仪器与设备 |
| 3.1.2 主要材料与试剂 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.1.4 步骤与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 氨肽酶的分离纯化 |
| 3.2.2 蛇毒中氨肽酶分离纯化效果及分子量的确定 |
| 3.2.3 蛇毒中氨肽酶浓度的测定 |
| 3.2.4 蛇毒中氨肽酶性质的的测定 |
| 3.3 讨论 |
| 4 蛇毒中PLA_2的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要仪器与设备 |
| 4.1.2 主要材料与试剂 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.1.4 方法与步骤 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 PLA_2的分离纯化 |
| 4.2.2 蛇毒中PLA_2分离纯化效果及目标组分纯度检测 |
| 4.2.3 PLA_2浓度的测定 |
| 4.2.4 PLA_2性质的测定 |
| 4.3 讨论 |
| 5 全文小结 |
| 6 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录A 作者攻读硕士学位期间发表论文及科研情况 |
| 致谢 |
（4）银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略对照表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 中药动物药之蛇类入药 |
| 第二章 蛇类毒素的研究概况 |
| 2.1 蛇类毒素的转录组研究 |
| 2.2 蛇类毒素的蛋白组研究 |
| 第三章 蛇毒L-氨基酸氧化酶的研究进展 |
| 3.1 蛇毒L-氨基酸氧化酶的组成和结构功能 |
| 3.2 蛇毒L-氨基酸氧化酶的药理学活性与应用价值 |
| 3.2.1 细胞毒性作用 |
| 3.2.2 诱导细胞凋亡作用 |
| 3.2.3 对血小板聚集功能的影响 |
| 3.2.4 抑菌作用 |
| 3.2.5 抗肿瘤作用 |
| 3.2.6 其他作用 |
| 3.3 蛇毒L-氨基酸氧化酶分离、纯化与异源表达 |
| 3.3.1 粗毒中LAAO的分离、纯化 |
| 3.3.2 异源重组表达 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第四章 银环蛇毒腺高通量测序转录组文库的构建及分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 毒蛇 |
| 4.1.2 主要试剂与耗材 |
| 4.1.3 主要实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转录组文库构建及测序流程 |
| 4.2.2 毒腺的分离 |
| 4.2.3 总RNA的提取 |
| 4.2.4 总RNA的纯化 |
| 4.2.5 mRNA碎片化 |
| 4.2.6 转录组文库的构建与库检 |
| 4.2.7 上机测序 |
| 4.2.8 测序数据预处理 |
| 4.2.9 De novo拼接 |
| 4.2.10 生物信息学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 总RNA的制备与分析 |
| 4.3.2 测序数据过滤处理 |
| 4.3.3 拼接转录本分析 |
| 4.3.4 基因功能注释 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 第五章 银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与结构鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 蛇毒、菌种 |
| 5.1.2 层析柱和主要试剂 |
| 5.1.3 主要实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Sephadex G-75分离柱的安装 |
| 5.2.2 银环蛇粗毒的分离 |
| 5.2.3 Bm-LAAO的分离纯化及鉴定 |
| 5.2.4 Bm-LAAO的理化性质 |
| 5.2.5 酶学性质 |
| 5.2.6 酶促动力学 |
| 5.2.7 去糖基化 |
| 5.2.8 储存温度 |
| 5.2.9 Bm-LAAO的基因克隆 |
| 5.2.10 基因序列分析 |
| 5.2.11 三维空间结构建模 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 银环蛇粗毒分离 |
| 5.3.2 Bm-LAAO的分离纯化及肽质量指纹图谱分析 |
| 5.3.3 Bm-LAAO的理化性质分析 |
| 5.3.4 Bm-LAAO的纯化效率 |
| 5.3.5 酶学性质鉴定 |
| 5.3.6 酶促动力学分析 |
| 5.3.7 糖基化及储存温度对Bm-LAAO活性的影响 |
| 5.3.8 Bm-LAAO基因及蛋白序列分析 |
| 5.3.9 Bm-LAAO的三维结构 |
| 5.4 分析与讨论 |
| 5.4.1 银环蛇粗毒的分离 |
| 5.4.2 Bm-LAAO的分离纯化 |
| 5.4.3 Bm-LAAO的理化性质 |
| 5.4.4 Bm-LAAO的酶学性质 |
| 5.4.5 Bm-LAAO的序列及结构分析 |
| 5.4.6 Bm-LAAO的原核表达 |
| 第六章 银环蛇L-氨基酸氧化酶的抗肿瘤活性分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 细胞株 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 银环蛇组分的细胞增殖抑制率检测 |
| 6.2.2 Bm-LAAO对细胞生长的半抑制浓度(IC50)测定 |
| 6.2.3 Bm-LAAO对细胞凋亡作用的检测 |
| 6.2.4 H_20_2对细胞的增殖和凋亡作用的检测 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 银环蛇组分的细胞活力检测 |
| 6.3.2 Bm-LAAO抑制细胞的增殖 |
| 6.3.3 Bm-LAAO诱导细胞的形态学发生改变 |
| 6.3.4 Bm-LAAO可能通过产生H_20_2影响细胞的增殖和凋亡 |
| 6.4 分析与讨论 |
| 6.4.1 LAAO对多种肿瘤细胞具有杀伤作用 |
| 6.4.2 LAAO对细胞凋亡的诱导作用 |
| 6.4.3 Bm-LAAO诱导肿瘤细胞凋亡的机理分析 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（5）中介蝮毒素组学研究：聚焦丝氨酸蛋白酶家族（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 转录组介绍 |
| 1.2 蛋白组介绍 |
| 1.3 目前已发现的主要蛇毒素家族介绍 |
| 1.3.1 蛇毒磷脂酶A2(PLA2) |
| 1.3.2 蛇毒金属蛋白酶(MP) |
| 1.3.3 蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO) |
| 1.3.4 蛇毒磷酸二酯酶(PDE) |
| 1.3.5 透明质酸酶(Hydase) |
| 1.3.6 富含半胱氨酸的分泌蛋白(CRISP) |
| 1.3.7 神经生长因子(NGF) |
| 1.3.8 舒缓激肽增强肽(BPP-CNP) |
| 1.3.9 蛇毒C-型凝集素样蛋白(CTLP) |
| 1.3.10 三指毒素(3-FTx) |
| 1.4 蝮亚科主要毒蛇的组学研究进展 |
| 1.5 蛇毒丝氨酸蛋白酶家族研究概况 |
| 1.5.1 蛇毒丝氨酸蛋白酶超家族分类 |
| 1.5.2 蛇毒丝氨酸蛋白酶家族结构概述 |
| 1.5.3 几种已知空间结构的蛇毒丝氨酸蛋白酶结构与功能关系 |
| 1.5.4 蛇毒丝氨酸蛋白酶的分离纯化 |
| 1.5.5 丝氨酸蛋白酶活性检测常用底物 |
| 1.5.6 丝氨酸蛋白酶的临床应用 |
| 1.6 中介蝮研究现状 |
| 1.7 选题依据及意义 |
| 第2章 中介蝮毒素转录组分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 毒腺总RNA的提取 |
| 2.3.2 构建cDNA文库 |
| 2.3.3 转录组数据组装及分析 |
| 2.3.4 Gisps的系统进化树分析 |
| 2.3.5 实时定量PCR检测GiSPs的相对表达量 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 中介蝮毒腺总RNA质量检测 |
| 2.4.2 数据产量统计与质量评估 |
| 2.4.3 转录组数据组装结果 |
| 2.4.4 Unigene功能注释结果统计: |
| 2.4.5 PLA2家族分析 |
| 2.4.6 svSP家族分析 |
| 2.4.7 CRISP家族分析 |
| 2.4.8 CTLP家族分析 |
| 2.4.9 Hydase家族分析 |
| 2.4.10 svMP家族分析 |
| 2.4.11 L-AAO家族分析 |
| 2.4.12 其他低丰度毒素家族 |
| 2.5 本章小结与讨论 |
| 2.5.1 svSP家族讨论 |
| 2.5.2 CTLP家族讨论 |
| 2.5.3 svMP家族讨论 |
| 2.5.4 LAAO家族讨论 |
| 第3章 中介蝮毒素蛋白组分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 FASP酶解 |
| 3.3.2 LC-MS/MS质谱鉴定 |
| 3.4 实验结果及分析 |
| 3.5 本章小结与讨论 |
| 第4章 中介蝮丝氨酸蛋白酶家族的分离纯化及初步表征 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料及试剂 |
| 4.2.1 中介蝮粗毒 |
| 4.2.2 实验试剂与耗材 |
| 4.2.3 实验仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 中介蝮蛇毒采集及处理 |
| 4.3.2 蛋白浓度的测定 |
| 4.3.3 凝胶过滤层析 |
| 4.3.4 阴离子交换 |
| 4.4 实验结果及分析 |
| 4.4.1 凝胶过滤层析结果 |
| 4.4.2 阴离子交换层析结果 |
| 4.5 本章小结与讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间科研成果 |
（6）L-氨基酸氧化酶的研究进展（论文提纲范文）
| 1 LAAO分类与酶学性质 |
| 1.1 LAAO的分类 |
| 1.2 酶学性质 |
| 1.2.1 底物特异性和最适性 |
| 1.2.2 分子质量和等电点 |
| 1.2.3 热稳定性 |
| 1.2.4 活性检测方法 |
| 2 结构特征 |
| 3 与GR2家族蛋白酶的同源性分析 |
| 4 生物学功能 |
| 4.1 诱导细胞凋亡及机理 |
| 4.2 抑菌作用及机理 |
| 4.3 对血小板的作用及机理 |
| 4.4 抗艾滋病病毒及机理 |
| 4.5 其他生物学功能 |
| 5 异源表达 |
| 6 研究现状与展望 |
（7）白眉蝮蛇蛇毒L-氨基酸氧化酶的表征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、纯化 |
| 二、纯度和分子量 |
| 三、序列鉴定 |
| 四、酶学性质 |
| 五、金属离子作用 |
| 六、血小板作用 |
| 七、抗菌活性 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 缩写词 |
| 致谢 |
（8）白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分离纯化及理化性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 蛇的简介 |
| 1.1.1 蛇的分类 |
| 1.1.2 区别有毒和无毒蛇 |
| 1.1.3 蛇伤诊断与急救 |
| 1.1.4 蛇的用途 |
| 1.2 蛇毒 |
| 1.2.1 蛇毒蛋白 |
| 1.2.2 蛇毒的采集与加工 |
| 1.2.3 蛇毒蛋白在我国药学方面的应用 |
| 1.3 白眉蝮蛇 |
| 1.3.1 白眉蝮蛇简介 |
| 1.3.2 白眉蝮蛇蛇毒蛋白理化性质 |
| 1.3.3 白眉蝮蛇蛇毒酶的应用 |
| 1.4 5 ’-核苷酸酶 |
| 1.4.1 5 ’-核苷酸酶简介 |
| 1.4.2 蛇毒5’-核苷酸酶的理化性质 |
| 1.4.3 5 ’-核苷酸酶在医药的应用 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 5 ’-核苷酸酶研究的目的和意义 |
| 2.2 研究的主要内容 |
| 2.2.1 5 ’-核苷酸酶的分离纯化 |
| 2.2.2 5 ’-核苷酸酶理化性质研究 |
| 2.2.3 糖对酶的保护 |
| 2.2.4 5’-核苷酸酶抑制血小板聚集机制的研究 |
| 2.3 本研究的技术路线 |
| 第三章 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分离纯化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 粗毒的处理 |
| 3.3.2 DEAE-Sephadex A-25离子交换色谱分离 |
| 3.3.3 Sephadex G-75分子筛色谱分离 |
| 3.3.4 5 ’-核苷酸酶活测定 |
| 3.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 白眉蝮蛇5’-核苷酸酶活性方法可行性测定 |
| 3.4.2 DEAE-Sephadex A-25离子交换色谱分离 |
| 3.4.3 SDS-PAGE测A-25 5’-核苷酸酶 |
| 3.4.4 Sephadex G-75分子筛色谱分离 |
| 3.4.5 SDS-PAGE测G-75 5’-核苷酸酶 |
| 3.4.6 5 ’-核苷酸酶纯度鉴定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶理化性质 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂 |
| 4.2.3 其他试剂 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分子量的确定 |
| 4.3.2 糖蛋白的鉴定 |
| 4.3.3 温度对酶活的影响 |
| 4.3.4 pH对酶活的影响 |
| 4.3.5 金属离子对酶活的影响 |
| 4.3.6 抑制剂对酶活的影响 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分子量 |
| 4.4.2 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶糖蛋白鉴定 |
| 4.4.3 温度对酶活性的影响 |
| 4.4.4 pH对酶活的影响 |
| 4.4.5 常见金属离子对酶活的影响 |
| 4.4.6 抑制剂对酶活的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 糖对白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶的保护作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.1.1 果糖的生物功能 |
| 5.1.2 葡聚糖的生物功能 |
| 5.1.3 壳寡糖的生物功能 |
| 5.1.4 海藻糖的生物功能 |
| 5.1.5 其他多糖的生物功能 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 糖溶液配置 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶对血小板聚集的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.1.1 血小板聚集 |
| 6.1.2 蛇毒对血小板聚集与聚集抑制活性 |
| 6.2 材料与仪器 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 所需试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 血小板样品制备 |
| 6.3.2 酶对血小板聚集活性检测 |
| 6.3.3 不同剂量的酶对血小板聚集活性促进率检测 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 总结与讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 在读期间发布的论文 |
（10）舟山眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的分离纯化及对体内外抗血管生成作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| Ⅰ. NA-LAO 的分离纯化及理化性质测定 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 NAV-LAO 活性测定方法优化 |
| 2.2 NAV-LAO的分离纯化 |
| 2.2.1 眼镜蛇毒 SP Sepharose FF 阳离子柱析 |
| 2.2.2 Heparin Sepharose CL-68 亲和层析 |
| 2.3 NAV-LAO的理化性质 |
| 2.3.1 NAV-LAO 蛋白浓度的测定 |
| 2.3.2 NAV-LAO 纯度鉴定及相对分子质量测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 ODA、OPD、TMB 三种方法测定 NAV-LAO 活性 |
| 3.1.1 灵敏度比较 |
| 3.1.2 重复性测定 |
| 3.2 NAV-LAO 的分离纯化 |
| 3.2.1 眼镜蛇毒 SP Sepharose FF 阳离子柱层析 |
| 3.2.2 Heparin Sepharose CL-68 亲和层析 |
| 3.3 NAV-LAO 的理化性质 |
| 3.3.1 NAV-LAO 蛋白含量 |
| 3.3.2 NAV-LAO 纯度鉴定 |
| 4 讨论 |
| Ⅱ. NAV-LAO 的活性测定 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 NAV-LAO 对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）生长的影响 |
| 2.2 NAV-LAO对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）移动能力的影响 |
| 2.3 NAV-LAO对HUVEC细胞小管形成的影响 |
| 2.4 NAV-LAO对HUVEC细胞凋亡的影响 |
| 2.5 Western Blotting分析caspase3、caspase8激活的信号分子的表达 |
| 2.6 NAV-LAO对鸡胚尿囊膜（Chicken Chorioallantoic Membrane，CAM）血管生成的影响 |
| 3. 结果 |
| 3.1 NAV-LAO对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）生长的影响 |
| 3.2 NAV-LAO对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）移动能力的影响 |
| 3.3 NAV-LAO对HUVEC细胞小管形成的影响 |
| 3.4 Hoechst33342染色观察NAV-LAO对HUVEC细胞凋亡的影响 |
| 3.5 Western Blotting分析caspase-3、caspase-8激活的信号分子的表达 |
| 3.6 NAV-LAO对鸡胚尿囊膜（Chicken Chorioallantoic Membrane，CAM）血管生成的影响 |
| 4. 讨论 |
| Ⅲ. 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
四、眼镜王蛇(OPhiophagus hannah)毒中L-氨基酸氧化酶的分离纯化和理化性质的研究（论文参考文献）
- [1]我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选[D]. 王博. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN10的靶点拮抗机制及基于三代测序的青环海蛇多组学研究[D]. 李安. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]中华眼镜蛇蛇（Naja atra）毒中的两种重要成分（氨肽酶和PLA2）的分离纯化及其性质研究[D]. 刘锦花. 重庆师范大学, 2018(01)
- [4]银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定[D]. 胡玲玲. 南京师范大学, 2017(01)
- [5]中介蝮毒素组学研究：聚焦丝氨酸蛋白酶家族[D]. 杨玉娥. 陕西师范大学, 2016(04)
- [6]L-氨基酸氧化酶的研究进展[J]. 余志良,周宁,乔华. 中国生物工程杂志, 2012(03)
- [7]白眉蝮蛇蛇毒L-氨基酸氧化酶的表征[D]. 郭春梅. 大连医科大学, 2011(06)
- [8]白眉蝮蛇蛇毒5’-核苷酸酶分离纯化及理化性质研究[D]. 张秉怡. 昆明理工大学, 2010(03)
- [9]动物毒素与人类疾病——从单一成分到组学研究,从理化性质到疾病机理,从粗毒利用到理性药物设计[J]. 吕秋敏,赖仞,张云. 动物学研究, 2010(01)
- [10]舟山眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的分离纯化及对体内外抗血管生成作用[D]. 黄剑钧. 福建医科大学, 2009(10)