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洋葱布克氏菌（Burkholderia cepacia）酯酶酶法不对称拆分dl-薄荷醇研究

2020-11-28阅读(942)

洋葱布克氏菌（Burkholderia cepacia）酯酶酶法不对称拆分dl-薄荷醇研究

论文摘要

天然薄荷醇由于受天气和地域等的影响,产量和质量波动很大,近年来,利用生物法拆分dl-薄荷醇制备l-薄荷醇己经成为l-薄荷醇生产的研究热点。本文利用透明圈平板初筛与转化反应气相检测复筛相结合的方法,筛选出了一株具有高度不对称水解dl-乙酸薄荷酯生成l-薄荷醇的菌株洋葱布克氏菌（Burkholderia cepacia）;以此菌株为材料,对其培养条件,整细胞体系的转化条件进行了详细研究;并对该菌株细胞中立体选择性酯酶同工酶进行了分离纯化,研究了其酶学性质,为其进一步克隆表达和相关应用提供实验依据。主要工作包括:1)以提高单位发酵液中的酶活为目标,选择菌体生长和产酶为指标,利用响应面法对B. cepacia的培养条件和营养条件进行了优化,确定摇瓶发酵产酶的最优培养基组成为:葡萄糖2.27%,牛肉膏1.58%,蛋白胨1.83%,K2HPO40.42%,MgSO4·7H2O 0.02%,CaCl2 0.01%,NaCl 0.5%;较优环境条件为:接种量6%,培养温度30℃,装液量15%,初始pH值为7.07.5,培养时间为48 h;在此最优条件下进行摇瓶发酵产酶,产酶量比未优化时提高了2.3倍。2)采用硫铵盐析、疏水层析、离子交换层析和凝胶过滤对B. cepacia的胞内酯酶进行了分离纯化。同工酶Est1的比酶活提高了近3倍,为0.77 U/mg,分子量为66 kDa;同工酶Est2的比酶活提高了近23倍,为5.91 U/mg,分子量约为37 kDa。Est1和Est2的最适pH都为7.0,最适反应温度为30℃,活性中心都存在丝氨酸残基,且都不属于金属酶类。立体选择性受温度影响不明显,但受pH影响严重,pH过高或过低都会引起立体选择性的明显下降,添加大部分表面活性剂或抑制剂均使酶的立体选择性下降。Est1没有明显位置特异性,而Est2具有2-位特异性,它们都优先水解短链脂肪酸酯。除甲酸薄荷酯外,均优选短链l-型脂肪酸薄荷酯进行水解。因此,两目的酶都属于短链酯酶。Est1的N-末端氨基酸组成为:MHITTT,Est2的N-末端氨基酸组成为:MGARTDA,与已知Burkholderia sp.水解酶（酯酶/脂肪酶）均没有明显的同源性,说明Est1和Est2都可能是一种新酶,都属于羧酸酯酶大类（EC3.1.1.1）。3)对B. cepacia整细胞催化的dl-乙酸薄荷酯不对称水解制备l-薄荷醇的生物催化过程进行了研究。发现添加助溶剂可改变底物与酶的接触面积和整细胞的通透性,从而对催化反应转化率和产物ee值（对映体过剩量）有一定的影响,添加15%的二甲亚砜对反应速率和产物ee值都有提高作用,最佳反应条件为:pH 7.0,0.067 mol/L的Na2HPO4-KH2PO4缓冲体系,温度30℃,15%二甲亚砜,1%底物,15 g/L干细胞量,反应24 h。在此最优条件下得到的l-薄荷醇的光学纯度达95%以上。通过反应产物的分离纯化,纯化得率为85%,l-薄荷醇单次循环总收率为66%,说明了先对dl-薄荷醇进行化学酯化再通过B. cepacia整细胞催化的不对称拆分制备l-薄荷醇是完全可行的。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  • 1.1 生物拆分的意义与原理
  • 1.1.1 生物拆分的意义
  • 1.1.2 生物拆分的原理
  • 1.2 Burkholderia sp.酯水解酶研究背景
  • 1.2.1 Burkholderia sp. 酯酶/脂肪酶的应用研究
  • 1.2.2 Burkholderia sp.酯酶催化酯水解反应机制
  • 1.2.3 Burkholderia sp. 酯酶的分离纯化
  • 1.3 薄荷醇的性质及用途
  • 1.3.1 d-薄荷醇与l-薄荷醇的主要区别
  • 1.3.2 主要应用
  • 1.4 薄荷醇的制备方法及工艺
  • 1.4.1 物理方法
  • 1.4.2 化学方法
  • 1.4.3 生物催化合成
  • 1.5 薄荷醇的手性拆分
  • 1.5.1 利用光学活性试剂拆分
  • 1.5.2 利用非光学活性试剂拆分
  • 1.5.3 生物拆分
  • 1.6 国际上dl-薄荷醇的代表性生物拆分工艺
  • 1.6.1 南非CSIR 公司
  • 1.6.2 德国Haarmann-Reimer 公司
  • 1.6.3 酶促酯化/转酯化方法与酶促水解方法比较
  • 1.7 立题的背景与意义
  • 1.7.1 立题的背景
  • 1.7.2 立题的意义
  • 1.8 论文主要工作
  • 第二章 高效水解l-乙酸薄荷酯立体选择性酯酶产酶微生物筛选
  • 2.1 前言
  • 2.2 实验材料
  • 2.2.1 菌种来源
  • 2.2.2 主要试剂
  • 2.2.3 主要仪器设备
  • 2.2.4 培养基配制
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 d-乙酸薄荷酯、dl-乙酸薄荷酯的制备
  • 2.3.2 分析方法
  • 2.3.3 乙酸薄荷酯水解酶产生菌的筛选
  • 2.3.4 细胞干重的测定
  • 2.3.5 不同有机溶剂对萃取率的影响
  • 2.3.6 电镜条件
  • 2.4 结果与讨论
  • 2.4.1 d-乙酸薄荷酯、dl-乙酸薄荷酯的制备
  • 2.4.2 气相色谱条件的选择
  • 2.4.3 最佳萃取溶剂的选择
  • 2.4.4 乙酸薄荷酯水解菌株的筛选
  • 2.4.5 B. cepacia ATCC 25416 传代稳定性考察
  • 2.4.6 B. cepacia ATCC 25416 在批式反应中的催化稳定性
  • 2.4.7 B. cepacia 水解酶与商品化水解酶比较
  • 2.4.8 B. cepacia ATCC 25416 的菌落形态及电镜照片
  • 2.5 本章小结
  • 第三章 B. cepacia 发酵产l-乙酸薄荷酯水解酶过程研究
  • 3.1 前言
  • 3.2 实验材料
  • 3.2.1 菌种
  • 3.2.2 培养基
  • 3.2.3 主要仪器设备
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 菌种的培养
  • 3.3.2 干细胞的制备
  • 3.3.3 细胞干重的测定
  • 3.3.4 残糖含量的测定
  • 3.3.5 微生物细胞催化的不对称水解反应
  • 3.3.6 反应产物光学纯度及反应转化率的测定
  • 3.3.7 酶活测定方法
  • 3.3.8 实验设计
  • 3.4 结果与讨论
  • 3.4.1 培养基组成对菌体产胞内l-乙酸薄荷酯水解酶的影响
  • 3.4.2 环境条件对菌体产整细胞l-乙酸薄荷酯水解酶的影响
  • 3.4.3 B. cepacia ATCC 25416 生长及产酶的时间进程
  • 3.5 本章小结
  • 第四章 B. cepacia 立体选择性酯酶同工酶的分离纯化
  • 4.1 前言
  • 4.2 实验材料
  • 4.2.1 试剂
  • 4.2.2 菌种
  • 4.2.3 培养基
  • 4.2.4 溶液配制
  • 4.2.5 主要设备
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 菌种的培养
  • 4.3.2 反应产物光学纯度及反应转化率的测定
  • 4.3.3 酶活力测定方法
  • 4.3.4 粗酶底物特异性的测定方法
  • 4.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
  • 4.3.6 蛋白质转膜
  • 4.3.7 l-乙酸薄荷酯水解酶的纯化
  • 4.3.8 蛋白含量的测定
  • 4.3.9 蛋白分子量测定
  • 4.3.10 N-末端氨基酸序列的测定
  • 4.4 结果与讨论
  • 4.4.1 B. cepacia 立体选择性水解酶胞内外分布的测定
  • 4.4.2 硫铵饱和度的确定
  • 4.4.3 粗酶的底物特异性
  • 4.4.4 疏水柱层析
  • 4.4.5 同工酶Est1 的分离纯化
  • 4.4.6 同工酶Est2 的分离纯化
  • 4.5 本章小结
  • 第五章 立体选择性酯酶同工酶的酶学性质研究
  • 5.1 前言
  • 5.2 实验材料
  • 5.2.1 水解酶
  • 5.2.2 试剂
  • 5.3 实验方法
  • 5.3.1 酶最适反应pH 及pH 稳定性的测定
  • 5.3.2 酶最适反应温度及温度稳定性的测定
  • 5.3.3 金属离子、螯合剂等的影响
  • 5.3.4 表面活性剂、抑制剂的影响
  • 5.3.5 酶的三油酸甘油酯位置选择性
  • 5.3.6 酶的芳香族脂肪酸酯链长专一性
  • 5.3.7 酶的羧基薄荷酯立体专一性
  • 5.4 结果与讨论
  • 5.4.1 pH 对同工酶酶活力的影响
  • 5.4.2 pH 对同工酶酶稳定性的影响
  • 5.4.3 温度对同工酶酶活力的影响
  • 5.4.4 温度对同工酶酶稳定性的影响
  • 5.4.5 金属离子、螯合剂的影响
  • 5.4.6 表面活性剂、抑制剂的影响
  • 5.4.7 三油酸甘油酯位置选择性
  • 5.4.8 芳香族脂肪酸酯链长专一性
  • 5.4.9 羧基薄荷酯立体专一性
  • 5.4.10 B. cepacia 胞内酯酶同工酶Est1、Est2 比较
  • 5.4.11 Est1 与Est2 N 端氨基酸序列同源性比较
  • 5.5 本章小结
  • 第六章 B. cepacia 整细胞催化dl-乙酸薄荷酯水解反应过程研究
  • 6.1 前言
  • 6.2 实验材料
  • 6.2.1 菌种
  • 6.2.2 培养基
  • 6.2.3 主要试剂
  • 6.2.4 主要仪器、设备
  • 6.3 实验方法
  • 6.3.1 菌种的培养
  • 6.3.2 干细胞的制备
  • 6.3.3 反应介质的选取
  • 6.3.4 反应助溶剂的选取
  • 6.3.5 最适反应pH 实验
  • 6.3.6 最适干细胞量实验
  • 6.3.7 最适底物浓度实验
  • 6.3.8 最适温度实验
  • 6.3.9 最适搅拌转速实验
  • 6.3.10 最适反应时间实验
  • 6.3.11 反应产物光学纯度及反应转化率的测定
  • 6.3.12 反应初速度的测定
  • 6.3.13 l-薄荷醇的分离提取
  • 6.3.14 l-薄荷醇的鉴定
  • 6.3.15 薄荷醇旋光度的测定
  • 6.4 结果与讨论
  • 6.4.1 整细胞催化不对称水解反应体系的建立
  • 6.4.2 整细胞催化不对称水解反应条件的研究
  • 6.4.3 产物浓度对整细胞催化的不对称水解反应的影响
  • 6.4.4 l-薄荷醇的分离提取及鉴定
  • 6.5 本章小结
  • 结论与展望
  • 论文创新点
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文

    • 相关论文文献

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