论文摘要
为了了解CIPK14与EGY1基因受环境因子调节的分子机制,本文通过自行构建目的基因突变体,以及结合现有模式植物拟南芥的一系列T-DNA突变体为材料,系统地研究了CIPK14与EGY1基因在胁迫应答过程中的作用,及CIPK14基因的钙调节属性,和EGY1基因在MEP代谢途径中的调节作用。首次探讨了CIPK14与EGY1基因受光调节和时钟节律性表达的特异性,及EGY1基因通过光信号途径影响拟南芥花青素合成的分子机理。论文的研究结果如下:（1）通过分析ABA（100μM）和盐（300mM）胁迫条件下拟南芥野生型中CIPK14基因的表达情况,发现CIPK14的转录水平在胁迫处理2小时后便迅速增加,并随处理时间延长而不断提高,处理6h时即达到峰值。说明CIPK14基因的转录受到环境胁迫的诱导;进一步比较CIPK14T-DNA插入突变体和野生型经ABA和盐处理后一系列胁迫应答基因（RA29A,RD29B,RAB18,KIN1/2,DREB1A,DREB2A,SOS2）的表达情况发现,由于CIPK14基因功能缺失导致这些被检测胁迫应答基因的转录水平都不同程度地降低或表达滞后,说明CIPK14基因在胁迫应答中起作用;最后比较了在不同浓度渗透剂（NaCl,ABA,sucrose,glucose,fructose,mannatil）处理下的突变体和野生型种子萌发、根伸长和叶片持水性等性状,结果发现,CIPK14突变体的种子萌发和根伸长对各种渗透胁迫均敏感,叶片持水能力也因为CIPK14基因功能缺失而减弱,并且ABA合成抑制剂哒草伏（Norflurazon）能部分恢复突变体对ABA、盐等胁迫敏感的表型。这一系列生理学试验研究进一步证明CIPK14是胁迫应答相关基因。（2）钙是植物体内常见的胁迫信号传递中的第二信使,为了确定CIPK14激酶活性是否受到胞内钙离子浓度的影响,我们考查了外源钙（0,0.1,1,10,100mM）对CIPK14基因表达的影响,研究发现,CIPK14的转录受到极端浓度（0,0.1,100mM）下外源钙的激活,说明外源钙能调节CIPK14基因的表达;进一步比较CIPK14T-DNA插入突变体和野生型经0.25μMABA和125mM盐处理的同时,再置于不同浓度（0,0.1,1,10,100mM）的外源钙条件下,胁迫应答基因RD24A的表达情况发现,突变体中RD29A基因的表达与野生型相比受外源钙的影响明显减弱,说明CIPK14基因功能缺失导致受钙调节的胁迫相关基因对外源钙的敏感性下降。后续的生理学试验研究表明,突变体种子萌发和根伸长与野生型相比对外源钙不敏感。胁迫条件下用不同浓度的外源钙（0,0.1,1,10,50mM）处理后,突变体种子的萌发率仍维持在45～55%之间的范围内,相反,在Ca2+浓度低于1mM及150mMNaCl处理下,野生型种子几乎不萌发。少数萌发的突变体和野生型种子都不能最后成苗。从而更深入地证明CIPK14基因接受钙信号调节,作用于拟南芥ABA和盐胁迫应答信号途径,并且CIPK14基因在胁迫信号转导途径中是位于转录因子（RD29A,RD22等）上游,而位于钙信号下游。（3）植物体内生物钟通过调控节律的相位来调节植物的生理活动。微阵列实验表明至少有6%的拟南芥基因是节律性表达的,其中68%的节律调控基因都直接对环境胁迫有响应。本实验首次发现CIPK14基因表达受到远红光的正调节,同时其表达具有生物时钟性,说明CIPK14是一类受光调节且表达具有时钟节律性的胁迫相关基因;另外研究发现,CIPK14突变体种子萌发受到远红光抑制的同时,突变体在远红光培养下产生的黄化苗转入白光培养后,其去黄化的速度比phyA滞后15h以上,比col-4滞后5h以上,RT-PCR分析NADPH:原叶绿素酸酯氧化还原酶POR基因的表达显示,CIPK14基因功能缺失导致POR基因的转录水平下降。已有研究表明远红光通过phyA介导的途径抑制POR基因的表达从而阻碍拟南芥去黄化,结合我们的结果推测CIPK14可能在拟南芥phyA介导的远红光抑制去黄化过程中起负调控作用。（4）通过分析ABA（100μM）和盐（300mM）胁迫条件下拟南芥野生型中EGY1基因的表达情况,发现EGY1的转录水平在胁迫处理3小时后便急速降低。说明EGY1基因的转录受到环境胁迫的抑制;但进一步比较EGY1缺失突变体和野生型经ABA和盐处理后一系列胁迫应答基因（RD29A,KIN2）的表达情况发现,EGY1基因功能缺失并不影响这些被检测基因受胁迫诱导的强度,同时研究发现EGY1缺失突变体种子萌发对ABA和盐胁迫不敏感,说明EGY1可能不直接参与胁迫信号的感知与传递,但作为固醇转录因子结合蛋白,EGY1可能通过调节植物次生代谢途径中相关酶的活性,从而影响ABA或其他次生代谢物的积累来对外界环境胁迫作出应答。（5）本实验成功筛选得到EGY1基因共抑制突变体。研究发现EGY1基因的表达抑制导致拟南芥叶绿素合成受阻,并且发现EGY1功能缺失导致叶绿素合成途径（MEP）关键酶（DXR、GGPPS1、POR）基因表达减弱,受光调节反应滞后,说明EGY1可能参与激活叶绿素合成途径（MEP）相关酶基因的表达。通过分析拟南芥MVA和MEP两条次生代谢途径限速酶抑制剂MEV（0,0.5,5mM）和FSM（0,20,50μM）作用下EGY1基因表达的变化情况,发现EGY1基因由于这两条途径的阻断表达增加,表达量随抑制剂浓度的升高而增强。另外用MEP途径终产物之一GA处理,EGY1的表达与前面ABA及盐的诱导一致。这两组实验进一步支持了我们认为EGY1可能调节植物次生代谢途径相关酶合成,并受到相关终产物的反馈调节的推断,但这些结论还需要更深入的实验证明。（6）研究还发现随着MS培养基中盐浓度（0,75,100,125mM）的升高,拟南芥植株花青素含量也相应增加。但EGY1突变体在相同条件下花青素的含量增加较缓慢,比较黑暗条件下突变体和野生型体内花青素合成酶基因（PAL、CHS）受盐胁迫诱导的情况,发现两者并没有明显差异,已有研究证明PAL和CHS基因表达受光诱导,尤其是受蓝光的强烈诱导,因此我们推测盐胁迫下通过EGY1促进花青素合成需要光信号来激活。（7）本实验首次发现EGY1同时受到光和生物钟的调节。RT-PCR分析表明,EGY1功能缺失导致蓝光下花青素合成关键酶（PAL、CHS）基因表达减弱,说明EGY1可能在拟南芥蓝光促进花青素合成过程中起正向调节作用。