Nrf2及齐墩果酸在酒精性肝纤维化中的作用机制研究

论文摘要

核因子相关因子-2（Nrf2）是肝脏细胞防御氧化应激的重要调节因子,通过介导一系列抗氧化酶和2相解毒酶的表达,降低各种药物、毒素、化学致癌物等有害物质肝毒性。酒精是引起氧化应激常见损害因素之一,酒精性肝纤维化是临床常见病,部分病人戒酒后并不能完全阻止肝纤维化进展。齐墩果酸是一种传统护肝药物,主要成分五环三萜类化合物,可从多种中药中提取,其保肝作用具体分子生物学机制尚不明确。国外有研究证明人工合成三萜类化合物对Nrf2-keap通路有显著激活作用。本研究旨在观察Nrf2在小鼠酒精性肝纤维化（ALF）中表达情况,探讨齐墩果酸抗纤维化作用分子生物学机制,为ALF的预防和治疗提供新的思路。实验目的：1.观察通过酒精灌胃的方法建立昆明种小鼠肝纤维化模型情况。并检测肝纤维化小鼠血清ALT、AST及TBIL水平及总结肝组织病理改变特点。2.观察核因子相关因子-2（NF-E2-related Factor 2, Nrf2）在小鼠酒精性肝纤维化（alcoholic liver fibrosis, ALF）表达情况。3.观察齐墩果酸对正常小鼠及饮酒小鼠肝细胞Nrf2表达情况。4.观察齐墩果酸预处理能否减轻肝细胞炎症侵润、改善肝细胞损伤,预防或减缓纤维化进程,探讨抗纤维化分子生物学机制。5.观察齐墩果酸对正常小鼠及饮酒小鼠肝细胞增殖及凋亡影响。6.研究酒精对小鼠单核巨噬细胞激活情况,为下一步探索其在肝纤维化进程中作用机制奠定基础。研究方法：30只昆明种健康雌性小鼠,正常饲养适应环境1周后,随机分为4组：模型组（B组）10只,通过50%酒精灌胃（gastric infusing, ig）建立小鼠酒精性肝纤维化动物模型；治疗组（C组）10只,预先给予齐墩果酸灌胃进行干预,酒精灌胃方法同模型组；对照组：A1组5只,只应用生理盐水灌胃作为对照。A2组5只,只应用齐墩果酸灌胃作为对照。四组均自由饮水和进食分笼喂养于20-25℃明暗各12小时的动物中心实验室内,分别于12周末以10%的水合氯醛（3-5ml/kg）腹腔注射麻醉处死（处死前隔夜禁食）。处死小鼠2小时前,腹腔注射250mg/kg BrdU（标记增殖肝细胞）。采血途径为心脏穿刺取血,离心后取血清,于-20℃保存。迅速收获肝脏标本,3/4部分用10%的甲醛溶液固定,制作石蜡切片,1/4部分液氮快速冰冻后储存于-80℃冰柜中,用于制备RNA悬液等。标本分批作如下检测：1.血清标本送检临床生化室,应用全自动生化分析仪检测血清酶学指标ALT、AST及TBIL水平；2.肝脏石蜡切片常规HE染色观察各组小鼠肝脏组织病理学改变（炎细胞浸润、肝实质细胞坏死分级情况参照Thompson慢性肝损害评分标准）；MT染色评价纤维化情况,并应用图像分析系统量化分析；3.免疫组化及免疫荧光方法检测Nrf2在对照组及模型组中表达情况及齐墩果酸预处理对酒精性肝纤维化小鼠Nrf2的表达影响；检测各组小鼠细胞外基质蛋白FN的表达；应用ER-MP23抗体（抗巨噬细胞凝集素特异性单克隆抗体）标记免疫荧光方法检测巨噬细胞激活及侵润情况。应用BrdU标记免疫组化方法检测各组小鼠肝细胞增殖情况。应用TUNEL（原位末端标记法）染色法检测原位肝细胞凋亡情况。4.肝脏冰冻标本送检分子生物学实验室,定量RT-PCR法检测各组小鼠纤维化相关因子CollagenⅠα、TGF-β1、α-SMAmRNA的表达水平。实验结果：1.血清酶学改变A1及A2对照组小鼠ALT、AST及TBIL水平无显著性差别（p>0.05）。模型组小鼠ALT、AST及TBIL水平较对照组均有显著升高（p<0.05）。齐墩果酸治疗组小鼠ALT、AST及TBIL水平较模型组有显著下降（p<0.05）。2.病理组织学改变HE染色结果：对照组A1及A2组小鼠肝小叶结构和汇管区、细胞形态均正常,未见明显炎细胞侵润。模型组小鼠肝细胞变性严重,见散在的多发灶状甚至结节样坏死,小叶中央区及汇管区见大量炎症细胞浸润,以单核细胞、淋巴细胞为主,并有一些中性粒细胞浸润。治疗组情况较模型组炎细胞浸润及肝细胞坏死情况相对较轻。治疗组与模型组炎细胞浸润评分情况分别为1.90±0.74 vs 2.70±0.95（p<0.05）；肝细胞损伤比较评分情况分别为1.80±0.79 vs 2.40±0.51（p<0.05）。MT染色结果：对照组A1及A2组小鼠肝脏组织仅在血管周围见极轻微纤维化（蓝色部分）,且两个对照组间无显著差别。模型组小鼠肝组织汇管区及中央静脉周围见较多纤维组织分割,较宽,且相互连接、融合。治疗组纤维化范围较模型组明显减小,且纤维分隔多纤细。形态学测量分析分别为1.86±1.23%VS3.55±1.37%（p<0.05）,差异有统计学意义。3.免疫组化及免疫荧光染色Nrf2表达情况：A1及A2对照组小鼠,Nrf2在极少数肝细胞胞浆中表达,且两个对照组间无显著差别；模型组小鼠肝细胞胞浆Nrf2表达明显增强；治疗组小鼠Nrf2在肝细胞胞浆中表达显著强于模型组小鼠,分别为92.31±15.45VS69.31±12.18（p<0.01）。FN表达情况：A1及A2对照组小鼠极少量FN表达,两个对照组间无显著差别。模型组小鼠FN表达明显增强。治疗组小鼠FN的表达与模型组相比明显减弱,分别为2.32±1.13%VS5.17±2.05%（p<0.05）。巨噬细胞免疫荧光染色：A1及A2对照组小鼠肝脏见极少数ER-MP23阳性细胞,且两个对照组间无显著差别。模型组与治疗组小鼠ER-MP23阳性细胞数分别为（178±35个/mm2VS113±29）个/mm2,p<0.05),治疗组巨噬细胞数目明显减少,差异有统计学意义。原位肝细胞凋亡情况：A1及A2对照组小鼠仅见极少数肝细胞凋亡,且两个对照组间无显著差别。模型组与治疗组小鼠凋亡细胞数分别为（232±45个/mm2VS209±27）个/mm2,p>0.05),治疗组小鼠肝细胞凋亡有所减少,但差异无统计学意义。肝细胞增殖分析：A1及A2对照组小鼠仅见极少数BrdU阳性肝细胞（1.09±1.03% VS 1.15±1.24%,p>0.01）,且两个对照组间无显著差别。模型组与治疗组小鼠BrdU阳性细胞数分别为（2.35±1.21%VS2.75±1.06%, p>0.05）,治疗组肝细胞增殖率较模型组略高,但差异无统计学意义。4.定量RT-PCR测定情况。四个组小鼠肝组织COL1α、TGF-β1及a-SMAmRNA表达结果一致。A1及A2对照组小鼠肝脏组织几乎未见COL1α、TGF-β1及α-SMAmRNA表达。模型组小鼠COL1α、TGF-β1及α-SMAmRNA表达水平明显升高。齐墩果酸预处理组较模型组明显下降,差异有统计学意义。结论：1.采用酒精灌胃方法12周可以成功建立小鼠ALF模型。该造模方法符合人类饮酒特点,简便易行且成功率高,是一种有效的造模方法。2.Nrf2在酒精性肝纤维化小鼠肝组织中表达增加,原因考虑肝细胞对酒精引起氧化应激损伤产生保护性反应所致。齐墩果酸能增强饮酒小鼠肝脏Nrf2表达,但对正常小鼠肝脏Nrf2表达无影响。3.齐墩果酸能显著降低饮酒小鼠的血清ALT、AST、TBIL水平,减轻肝细胞的变性、坏死、炎细胞反应以及肝小叶纤维化。齐墩果酸对正常对照组小鼠血清ALT、AST、TBIL水平及COL1α、α-SMA、TGF-β1 mRNA表达并无影响。齐墩果酸对正常小鼠肝脏组织病理学无影响。其保肝及抗纤维化分子生物学机制可能是通过增强酒精损伤肝细胞Nrf2表达,诱导下游抗氧化基因表达,保护肝细胞对抗氧化应激,减少巨噬细胞激活及侵润,降低TGF-β1 mRNA的表达,阻止星形细胞的激活,下调COL1α的表达,减少细胞外基质蛋白的合成与和蓄积而实现其抗纤维化作用的。4.齐墩果酸对正常小鼠肝细胞增殖与凋亡无影响。但能在一定程度促进饮酒小鼠肝细胞增殖,并降低肝细胞凋亡率,但与模型组小鼠相比无显著差别。肝细胞增殖与凋亡有多重机制参与,齐墩果酸可能仅对其中某方面机制有决定作用,故无法从总增殖与凋亡水平得到有统计学意义差别。5.饮酒可激活小鼠肝脏巨噬细胞,考虑与酒精诱导产生的氧化应激（可介导免疫应答）有关。巨噬细胞（枯否氏细胞）激活后可分泌抗炎性细胞因子（TGF-β1及IL-10）,促进纤维化因子TGF-β1、血管紧张素Ⅱ（AngiotensionⅡ, ANGⅡ）表达,进一步激活肝脏星形细胞转化为胶原分泌型成肌纤维细胞,促进纤维连接蛋白及胶原合成与沉积,这可能是促进和维持炎症反应,最终发生肝纤维化的主要因素。

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