阿维菌素对日本沼虾的毒性作用及其药物代谢动力学研究

论文摘要

长三角地区是我国日本沼虾（Macrobrachium nipponense）的主要养殖区,但近年来由于养殖污染、养殖技术等原因导致日本沼虾的产量急剧下降,市场供不应求。而鱼虾混养模式中日本沼虾亩增产效益高达1倍-2倍,可谓开辟了一条新路。阿维菌素类药物（Avermectins,AVMs）是由阿维链霉菌素通过自然发酵产生的一类大环内酯类抗生素,阿维菌素类药物作为一类生物农药,并具有化学结构新颖,作用机制独特,杀虫活性强,杀虫谱广等特点,已被广泛应用于水产养殖中,在用于鱼虾蟹混养塘中治疗三代虫、指环虫、鱼虱等寄生虫防治时,阿维菌素的毒性作用常引起同池养殖的日本沼虾中毒死亡事件。本文结合当前的养殖状况初步研究了阿维菌素对日本沼虾的毒性作用及在其体内的药物代谢动力学。以期为阿维菌素在水产养殖中提供更加科学的用药依据。以24h换液药浴法进行测定AVM对日本沼虾的急性毒性试验,阿维菌素对日本沼虾96h半致死浓度为0.0533ug/ml,95%的置信区间为0.0495～0.0573ug/ml,SC为0.0053ug/ml。建立了阿维菌素在日本沼虾体各组织（肌肉、肝胰腺、血淋巴）和水体中的反相高效液相色谱紫外检测法。各组织试样和水样经乙酸乙酯提取,45℃下氮气吹干,正己烷去脂净化,色谱柱采用Hypersil C18反相色谱柱,流动相:甲醇-水（86+14）,流速1.OmL/min,紫外检测器波长245nm,进样量lOuL的色谱条件下进行反相高效液相色谱-紫外检测。结果显示阿维菌素质量浓度在0.005～2mg/l范围内与峰面积呈线性关系,日本沼虾肌肉、肝胰腺、血淋巴平均添加回收率分别为89.4%～102.4%、95.3%～98.9%、86.7～100.6%,日内相对标准偏差（n=6）分别为2.1%～7.2%、2.0～4.3%、3.9～7.9%,日间相对标准偏差（n=6）分别为5.5%～8.4%、6.4～8.0%、5.3～8.9%,方法的检出限（3S/N）分别为0.002ug/ml、0.004ug/ml、0.004ug/ml。水样中的平均添加回收率为88.8%～95.7%,日内相对标准偏差（n=6）为3.3%～5.4%,日间相对标准偏差（n=6）为4.3%～6.0%,方法的检出限（3S/N）为0.002ug/ml。根据AVM在日本沼虾体内的毒性试验,确定了阿维菌素在日本沼虾体内的药代动力学实验给药剂量,即以0.005ug/ml浓度,以此为基础展开AVM在日本沼虾体内的药物代谢动力学的研究。在22～25℃实验水温的条件下采用药浴的方法,每24h换药水一次,换液一半,维持药物浓度恒定,共持续21d;21d之后每24h改换未添加阿维菌素的实验用水,直到40d。结果表明:AVM在日本沼虾组织中最高浓度由大到小依次为肝胰腺、血淋巴、肌肉。到20d时日本沼虾肌肉、肝胰腺、血淋巴中的AVM浓度均达到最高值且维持稳定状态,其中以肝胰腺中的浓度最高达到98.60ug/l,其次是血淋巴和肌肉组织分别是28.68ug/l和15.44ug/l。21d停止给药后,各组织中的药物浓度逐渐下降,药后40d日本沼虾各组织中阿维菌素已基本检测不到。由于种属差异、生理差异、给药剂量、给药途径、温度、盐度、pH值等因素的均能影响影响水生生物药代动力学残留,同种药物在不同水生生物体内的药代动力学参数有很大差异。因此应慎重将一种水生生物的临床给药剂量和休药期应用到另一水生生物。本实验条件下,AVM以0.005ug/ml浓度连续给药20天,建议其休药期最短为20天。研究了日本沼虾暴露在不同浓度的阿维菌素中组织的病理变化,结果表明AVM浓度0.005mg/l以上持续药浴27d日本沼虾的肝胰腺、触角腺、鳃等开始出现不同程度的组织损伤,其中肝胰腺在0.01mg/l浓度组下观察到肝胰腺明显肿大,肝小管间排列紧密,管内腔融合,界限模糊,到第27d时肝胰腺发生了严重的病理变化,肝细胞空泡变性,细胞核肿大、溶解、甚至消失,在虾体内还出现部分细胞坏死;触角腺在0.01mg/lAVM浓度组药浴23d后,端囊、肾管、迷路的许多细胞的细胞核浓缩,细胞肿大,细胞膜破裂,组织液流出,核仁散落到细胞质间隙中,还发现部分细胞死亡,组织出现了大量的空洞;鳃组织在0.01mg/lAVM浓度组药浴23d鳃丝部分上皮细胞核肿大,毛细血管扩张,基底膜肥大,鳃丝末端明显肿胀,鳃丝上皮细胞增生,细胞核肿大导致上皮细胞官腔堵塞,鳃丝由排列有序的的2-3层细胞变为无规则排列的多层细胞。到第27d时可观察到鳃上皮细胞空泡变性,部分上皮细胞核呈梭形,部分细胞脱落到细胞质中;肠在0.01mg/l浓度组药浴23d可观察到肠上皮细胞核肿大,细胞空泡变性,部分细胞出现坏死,肠绒毛内毛细血管扩张、充血。因此日本沼虾正常生存环境中AVM安全浓度不能高于0.005 mg/L。报道了上海市浦东新区部分地区日本沼虾肌肉组织中AVM的残留检测状况,结果表明这四个检测市场的日本沼虾中阿维菌素的残留量符合国家食品安全要求,市民可放心食用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1. 阿维菌素的理化性质与结构
• 2. 阿维菌素类的药理及其毒理作用
• 2.1 阿维菌素类的作用机制
• 2.2 AVMs的毒理作用
• 2.2.1 AVMs的一般毒性及特殊毒性
• 2.2.2 AVMs对环境的毒性
• 2.2.3 AVMs对水产动物的毒性
• 2.3 AVMs的应用
• 3.AVMs 的最高残留限量及检测方法的研究
• 3.1 AVMs 的最高残留限量及技术检测标标准
• 3.2 AVMs检测犯检测方法的概况
• 3.2.1 高效液相色谱－紫外检测法（HPLC-UV）
• 3.2.2 高效液相色谱－荧光检测法（HPLC-FLD）
• 3.2.3 液－质联用分析法（LC-MS）
• 3.2.4 酶联免疫法（ELISA）
• 3.2.5 其他检测方法
• 4.AVMs 药物药动学和消除规律的研究
• 4.1 AVMs在农畜动物体内的药动学和消除规律的研究
• 4.2 AVMs在水产动物体内的药动学和消除规律的研究
• 第一章 阿维菌素对日本沼虾的急性毒性
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 实验药物
• 1.2 实验方法
• 1.3 数据处理
• 2. 结果
• 2.1 中毒反应及相关症状
• 2.2 阿维菌素对日本沼虾的急性毒性
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第二章 建立阿维菌素在日本沼虾体内的检测方法
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 药品与试剂
• 1.2.1 药品
• 1.2.2 试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 色谱条件
• 1.5 样品处理
• 1.5.1 样品制备
• 1.5.2 肌肉、肝胰腺组织前处理
• 1.5.3 血淋巴组织前处理
• 1.5.4 水样前处理
• 1.6 标准曲线的绘制
• 1.7 最低检测限的测定
• 1.8 回收率、精密度的测定
• 2. 结果
• 2.1 色谱行为
• 2.2 标准曲线及检测限
• 2.3 回收率和精密度
• 3. 讨论
• 3.1 提取剂的选择
• 3.2 色谱条件的优化
• 3.3 前处理的优化及其方法的可行性分析
• 第三章 阿维菌素在日本沼虾体内的药物代谢动力学研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 实验药物
• 1.1.3 实验环境
• 1.2 实验方法
• 1.3 数据处理
• 1.4 休药期
• 2. 结果
• 2.1 实验用水中阿维菌素的浓度变化曲线
• 2.2 日本沼虾组织中阿维菌素浓度变化与分析
• 2.2.1 房室模型的确定
• 2.2.2 绘制药时曲线图
• 2.2.3 药代动力学参数
• 3. 讨论
• 3.1 阿维菌素在日本沼虾组织内的药代残留分析
• 3.1.1 肌肉
• 3.1.2 肝胰腺
• 3.1.3 血淋巴
• 3.2 药动参数
• 3.3 休药期的确定
• 4. 小结
• 第四章 阿维菌素对日本沼虾的组织病理
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 样品处理
• 1.3.1 脱水、透蜡、包埋
• 1.3.2 切片
• 1.3.3 苏木精-伊红染色
• 2. 结果
• 2.1 肝胰腺的组织病理变化
• 2.2 触角腺的组织病理变化
• 2.3 鳃的组织病理变化
• 2.4 肠的组织病理变化
• 3. 讨论
• 5. 小结
• 第五章 上海市浦东新区部分地区日本沼虾肌肉组织中 AVM 的残留状况
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验用虾
• 1.2 药品与试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 色谱条件
• 1.5 样品处理
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢