牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导不同细胞分泌炎性因子的差异性

论文摘要

慢性牙周炎（chronic periodontitis,CP）是人类常见的口腔感染性疾病之一。牙周炎的发生发展受到多种因素的影响。近来研究表明,牙周炎发生是由于牙周局部免疫防御机制的抑制而使得牙周致病菌定植、繁殖,其产生的多种毒力因子诱导宿主细胞释放多种炎性细胞因子或化学介质,从而导致局部的细胞毒性和免疫病理变化,造成牙周组织破坏,最终导致牙脱落。除引起牙齿缺失,影响消化系统的功能外,牙周炎还与心血管疾病、早产低体重儿、糖尿病等全身系统性疾病有关,严重影响了人类生活质量。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）是公认的可疑牙周致病菌之一,为产黑色素的革兰氏阴性厌氧菌。该菌具有一系列逃避宿主免疫防御机制和破坏宿主组织的毒力因子,如脂多糖（lipopolysacharides,LPS）、菌毛（fimbria）、牙龈素（gingipains）等,其中LPS被认为是Pg众多致病物质中最为重要的毒力因子。LPS是革兰氏阴性菌细胞外膜的主要成分,是一个关键的炎症介质。LPS作为一个潜在的细胞激活因子,可激活牙周组织中的多种靶细胞,包括免疫反应细胞（巨噬细胞和淋巴细胞）、具有防御作用的中性粒细胞、牙周细胞的主体细胞（成纤维细胞）、成骨细胞、破骨细胞等,促使其合成、分泌各种细胞因子及炎症介质,参与牙周组织创伤。其中TNF-α、IL-1B、IL-6和IL-8是具代表性的炎性细胞因子。牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）与典型的细菌内毒素大肠杆菌脂多糖（E.coli-LPS,E-LPS）的化学结构基本相似,仅生物活性部分脂质A磷酸化和酰基化形式有所不同。然而,LPS尽管结构上高度保守,但不同细菌来源的脂多糖仍具有重要的结构差异,可显著改变宿主反应。有研究报道Pg-LPS诱导炎症反应的活件弱于E-LPS,且对不同靶细胞致炎作用存在很大的差异性。众所周知,上皮细胞和成纤维细胞是牙周组织的主要细胞。作为牙龈结缔组织的主要成分的人成纤维细胞,在牙周病中起重要作用,可能与细菌和包括LPS在内的细菌产物直接相互作用。越来越多的证据表明上皮细胞不仅仅是一种机械屏障,同时也是一种先天免疫系统。目前的研究表明Pg感染人口腔上皮细胞后能检测到相应的细胞因子。单核-巨噬细胞通过分泌细胞因子来调节细菌的局部炎症应答,在炎症反应中起重要作用。根据以往相关的研究结果,我们发现Pg刺激牙周组织细胞、免疫反应细胞等能产生多种炎性细胞因子,但对Pg-LPS刺激上述细胞后分泌炎性细胞因子的变化过程却知之甚少。CP病变过程分静止期和活动期,并已肯定与牙周炎症急性发作和慢性发展直接相关。为此有必要对此进行进一步的探讨,为今后深入研究牙周病的发生发展及预防治疗做一些必要的铺垫。目的采用改良的热酚-水法从Pg ATCC 33277株中提取Pg-LPS,并获得纯化后的精制品。用鲎试验、红外光谱初步探讨Pg-LPS的生物活性和化学基本结构。探讨Pg-LPS诱导人口腔上皮细胞（KB细胞）、人牙龈成纤维细胞（HGF-1细胞）及人单核-巨噬样细胞（THP-1细胞）分泌炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的能力及其差异。方法1、采用改良的热酚-水法从Pg ATCC 33277株中提取Pg-LPS,并获得纯化后的精制品。采用鲎试验和红外光谱对提取的Pg-LPS进行鉴定。2、用不同浓度的Pg-LPS刺激①KB细胞;②HGF-1细胞;③THP-1细胞三种不同细胞持续不同时间后提取上清,采用ELISA试剂盒定量检测①TNF-α;②IL-1β;③IL-6;④IL-8四种不同细胞因子水平的变化。实验中采用商品化大肠杆菌O111:B4脂多糖（E-LPS）作为对照。结果1、Pg-LPS产量:Pg-LPS提纯品产量为1.3 mg/g湿菌（W/W）。2、Pg-LPS和E-LPS凝固鲎试剂所需最低浓度均为15 ng/ml,其红外光谱也极为相似。3、Pg-LPS或E-LPS诱导HGF-1细胞分泌的TNF-α和IL-1β水平呈峰形增高（P＜0.01）,但THP-1细胞为持续性升高（P＜0.01）。4、Pg-LPS或E-LPS诱导HGF-1或THP-1细胞分泌的IL-6水平呈持续性增强（P＜0.01）。5、Pg-LPS和E-LPS均可诱导THP-1细胞增强IL-8的分泌（P＜0.01）,但对HGF-1细胞仅Pg-LPS有促IL-8分泌的效应（P＜0.01）。6、Pg-LPS和E-LPS均不能诱导KB细胞分泌上述细胞因子。结论1、采用改良的热酚-水法提取的Pg-LPS产量较高。2、所提取的Pg-LPS具有细菌内毒素的基本特征,有较高的生物活性（≧15.0ng/ml）,可用于后续试验。红外光谱表明Pg-LPS和E-LPS为同型结构物。3、Pg-LPS有很强的促靶细胞分泌多种炎性细胞因子的生物学活性,从而引发初始的局部炎症反应。4、Pg-LPS致炎作用与E-LPS相似,但诱导不同炎性细胞因子的模式颇有差异。5、KB细胞不能作为LPS致炎作用的效应靶细胞。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验材料与试剂
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 学习期间参加课题与发表论文情况
• 致谢