普通小麦和黑麦葡萄糖基转移酶基因（GT1）的克隆与特征分析

论文摘要

由禾谷镰刀菌（Fusarium spp.）引起的小麦赤霉病是一种世界性病害。赤霉病不但影响小麦的产量和品质,而且感病籽粒中积累的真菌毒素对人畜健康存在很大威胁,培育低毒素小麦品种是控制这一危害的有效途径。目前已从赤霉病麦粒中鉴定了脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、3-乙酰氧基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-ADON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）3种真菌毒素,并发现这些毒素能够抑制真核蛋白的生物合成,且在植物的防卫反应中干扰基因的表达,其中DON极有可能是禾谷类作物重要的致病因子,但是对DON诱导后小麦基因的表达特点尚不了解,分离克隆小麦抗DON积累基因的工作也尚未见报道。本研究以高抗赤霉病小麦品种望水白为材料,经DON诱导后,通过基因芯片分析,获得了950条上调和165条下调表达序列,其中包括6条上调表达的葡萄糖基转移酶基因（GT1）。以EST BQ281752和BJ250503设计引物,以DON诱导的望水白cDNA为模板进行半定量RT-PCR分析,证实两基因均受DON诱导上调表达,且均在24h表达量最高,利用中国春缺体四体,将基因BQ281752和BJ250503分别定位于5D和2D。通过3′-RACE PCR,从DON诱导的望水白穗部中获得3条同源的cDNA序列,暂命名为NAU-1,NAU-2和NAU-3,其中NAU-1和NAU-2与BQ281752核苷酸同源性分别为91%和92%,NAU-3与BJ250503同源性94%。利用拟南芥DON降解基因DOGT1搜索小麦EST获得一条未注释功能的全长GT基因BT009372,根据该基因设计特异引物bt9372pF/R,从DON诱导的抗感赤霉病小麦望水白和感赤霉病小麦Alondra’S和绵阳85-45cDNA中获得3条全长基因,分别暂命名为NAU-4、NAU-5和NAU-6,其长度分别为1673 bp、1673 bp、1677 bp。比对分析发现3条基因均与来自中国春的BT009372的同源性达到99%,只有1%碱基存在差异,这些变异为转换。半定量RT-PCR分析发现,NAU-4不受DON诱导,且在望水白根、茎、叶和穗组织中均有相同表达,说明该基因可能为组成型表达基因。进一步利用引物bt9372pF/R,从小麦（望水白、Alondra’S和绵阳85-45）和荆州黑麦基因组中获得4条GT基因的全长gDNA序列,其长度分别为2002 bp（望水白）,2002 bp（Alondra’S）,2006 bp（绵阳85-45）,1963 bp（黑麦）,暂命名为NAU-7、NAU-8、NAU-9和NAU-10。与拟南芥GT基因仅包含一个外显子不同,小麦、黑麦和水稻均包含2个外显子和1个内含子,其中外显子较为保守,而内含子变化较大。系统进化分析发现,小麦、黑麦和水稻GT1基因相似性最高,与拟南芥、葡萄和烟草等双子叶植物的GT1基因相似性较低。进一步将小麦、黑麦GT1基因与拟南芥GT1家族成员进行聚类,发现小麦和黑麦的GT1基因与拟南芥GT1家族中的73C相似性最高。本研究成功构建了望水白GT1基因NAU-4的原核表达载体pET32a-NAU-4,通过转化大肠杆菌,证明该基因在大肠杆菌中能够稳定表达,且在温度28℃,培养6h,IPTG浓度为0.5 mmol/L的条件下表达量最大,证明克隆到的NAU-4为具有活性的基因。研究还构建了NAU-4的正义（132-NAU-4a）和反义（132-NAU-4b）农杆菌转化载体,为进一步进行遗传转化奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1.植物抗病基因克隆与功能分析
• 1.1 抗病基因克隆的意义
• 1.2 基因克隆的策略
• 1.2.1 图位克隆
• 1.2.2 转座子标签
• 1.2.3 表达序列标签法
• 1.2.4 cDNA文库筛选法
• 1.2.5 cDNA末端快速扩增
• 1.2.6 同源序列克隆
• 1.3 植物基因表达分析
• 1.3.1 体内表达
• 1.3.2 体外表达
• 1.4 植物抗病基因的分类
• 2.植物葡萄糖基转移酶基因的克隆与功能分析
• 2.1 糖基转移酶（GTases）基因的类别
• 2.2 拟南芥GT基因的克隆与功能分析
• 2.3 小麦DON积累抗性遗传与GT1基因克隆
• 第二部分 研究报告
• 一、材料与方法
• 1.材料
• 2.方法
• 2.1 总RNA提取
• 2.2 基因克隆
• 2.2.1 候选基因的选取
• 2.2.2 候选基因的克隆
• 2.2.3 候选基因扩增产物的回收和克隆
• 2.3 候选基因的半定量分析
• 2.4 大肠杆菌表达载体构建
• 2.5 目的蛋白的诱导表达和检测
• 2.5.1 目的蛋白的诱导表达
• 2.5.2 目的蛋白的检测
• 2.6 重组菌总蛋白的提取与目的蛋白的初纯化
• 2.6.1 重组菌总蛋白的提取
• 2.6.2 包涵体的洗涤
• 2.7 农杆菌载体的构建
• 2.8 农杆菌介导转化拟南芥
• 2.8.1 拟南芥的种植
• 2.8.2 农杆菌转化
• 2.8.3 转基因种子的潮霉素抗性检测
• 2.8.4 转基因植株PCR检测
• 2.9 基因的定位
• 2.10 生物信息学分析
• 2.10.1 不同小麦品种的GT基因的cDNA的比较分析
• 2.10.2 不同小麦品种及黑麦的GT基因gDNA的比较分析
• 二、结果与分析
• 1.DON诱导上调表达小麦GT1基因的克隆
• 1.1 BQ281752同源基因的克隆与特征分析
• 1.1.1 BQ281752半定量分析
• 1.1.2 BQ281752的染色体定位
• 1.1.3 从望水白中克隆BQ281752的同源基因
• 1.2 BJ250503同源基因的克隆与特征分析
• 1.2.1 BJ250503的半定量分析
• 1.2.2 BJ250503染色体定位
• 1.2.3 从望水白中克隆BJ250503的同源序列
• 2.组成型表达小麦GT1基因的克隆与特征分析
• 2.1 小麦GT1基因BT009372的同源基因克隆
• 2.2 望水白GT1基因NAU-4半定量RT-PCR分析
• 3 不同小麦品种和物种GT1基因cDNA和gDNA序列与进化分析
• 3.1 小麦、黑麦、水稻和拟南芥GT1全长gDNA的比较
• 3.2 GT1基因的系统进化
• 4 望水白GT1基因NAU-4的表达分析
• 4.1 原核表达
• 4.1.1 原核表达载体pET32a-NAU-4的构建
• 4.1.2 重组蛋白His-9372表达条件的优化
• 4.1.3 重组蛋白His-NAU-4提取与简单纯化
• 4.2 农杆菌介导的转化表达载体的构建
• 三、讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢