论文摘要
前言Paul Langerhans在1868年在上皮组织中首先观察到树突状细胞（dendriticcells,DC）,1973年Ralph Steinman在小鼠脾脏中分离成功,其参与免疫反应的诱导。近20年研究显示,DC源于骨髓的CD34+细胞,是体内功能最强的抗原递呈细胞,能摄取加工和递呈抗原,刺激初始型T细胞增殖,是机体免疫应答的始动者,在免疫应答的诱导中具有独特的地位。动物实验已经证实成熟DC经抗原冲击致敏后可诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞而杀伤肿瘤细胞。1996年Hsu等首次报道用肿瘤抗原肽冲击致敏的DC治疗B细胞淋巴瘤获得成功,此后,DC在抗肿瘤免疫治疗方面的应用前景得到了广泛的关注。对DC的基础和临床研究,必须基于有足够数量和纯度的DC。虽然DC广泛分布于全身各组织,但数量极微,同时缺乏特异性抗原标记,难以分离纯化。近年来,人们不断探索有效获得DC的方法,包括最初从含有DC的组织中通过密度梯度离心获得DC,以及后来用各种方法,如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）加肿瘤坏死因子（TNF-α）等,来培养产生DC,但各有利弊,所得DC数量和纯度不一,生物学特性也各样。本实验的目的是探索建立体外诱导DC的方法,并对不同方法培养的DC的特征做客观评价,以获得足够数量的典型DC,为主动治疗做准备。原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其中90%为肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）。HCC病情进展迅速,患者一经确诊,如不接受任何治疗,平均生存期仅为3-6个月。目前,手术切除及肝移植是治疗HCC的首选方法,但由于HCC起病隐匿,早期诊断困难;一旦出现典型临床症状,通常已失去手术时机;另外,即使接受手术治疗的患者,术后5年复发率亦高达40%-60%,术后高复发和转移是影响肝癌手术治疗中、远期效果的主要原因。因此,急需寻找新的有效的方法来降低肝癌的复发和转移,以期提高HCC治疗效果、降低复发率、延长患者生存期。随着免疫学和分子生物学的迅速发展,肿瘤生物治疗日益受到重视,显示了良好的应用前景。作为肿瘤生物治疗研究热点之一的DC,是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞,可表达丰富的MHC-Ⅰ,Ⅱ类分子及共刺激分子,获取、加工肿瘤抗原,并将其呈递至T淋巴细胞,诱导产生肿瘤抗原特异性CD4+和CD8+效应T细胞。目前已有多种DC介导的肿瘤免疫治疗方案,包括肿瘤特异性抗原肽致敏DC,编码肿瘤特异性抗原的基因转染DC,肿瘤细胞裂解物及肿瘤细胞总RNA致敏DC等。上述方法虽在体内、外实验中取得一定的预防和治疗效果,但目前已知的肿瘤特异性抗原很少,且存在肿瘤抗原异质性、MHC分子多态性等问题,另外,以肿瘤细胞裂解物和肿瘤细胞总RNA致敏DC,尚能引起对自身正常细胞的免疫应答,从而限制了上述方法的进一步应用。而将DC与肿瘤细胞融合的策略,可避免上述不足。理论上,将DC与肿瘤融合,可充分提呈肿瘤细胞已知和未知的抗原信息,有效活化多克隆CTL,诱导肿瘤特异性免疫反应;其次,通过细胞融合,肿瘤抗原可作为内源性抗原循MHC-Ⅰ类途径提呈至融合细胞表面,主要活化CD8+CTL,而后者是抗肿瘤免疫的主要效应细胞;而其他抗原致敏DC的方式则主要以MHC-Ⅱ类途径提呈抗原,活化CD4+Th细胞。鉴于DC-肿瘤融合策略具有上述优点,且HCC缺乏特异性抗原,故本课题采用细胞融合技术,构建DC-肝癌融合瘤苗,研究了其生物学特性及体内、外诱导免疫应答的能力,以期获得更强地活化CTL的瘤苗,为以DC融合瘤苗预防和治疗HCC的复发和转移奠定实验基础。但是,DC瘤苗在临床应用中尚存在一些问题:①DC体外培养繁琐、扩增有限;②细胞性瘤苗制备复杂、技术要求高、难以质控;③长期保存困难,临床大量应用受限。多烯紫杉醇（Docetaxel,DOC）是由浆果紫杉（Taxus baccata,European ye）针叶中提取的前体物,再经半合成的产物。结构与紫杉醇类似,抑制微管解聚的作用比紫杉醇更强。多烯紫杉醇用于乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、软组织肉瘤、头颈癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌等,单独用药和联合用药均有显著疗效。多烯紫杉醇和DC在体外和体内均证实具有一定的抗肿瘤效应。它们的抗肿瘤特性与他们的细胞毒性作用有关,但我们对它们的具体机制知之甚少,对其联合应用更无报道。本课题以人的HepG-2肝癌细胞和裸鼠皮下移植肝癌模型为研究对象,从体外和体内两方面探讨多烯紫杉醇和DC疫苗联合应用抗肿瘤的作用和机制。目的拟通过体外诱导DC的方式,分析不同体外培养条件与DC的生物学特征的相关性;观察负载抗原的DC联合多烯紫杉醇在体外对肝癌细胞的抑制与二者单独应用的区别,探讨新的肝癌细胞的杀伤方法;观察负载抗原的DC联合多烯紫杉醇在体内对肝癌模型中瘤体的抑制作用与二者单独应用的差异,为此方案的临床应用奠定基础。方法首先用三种不同培养条件培养大鼠骨髓的单个核细胞来诱生DC。第一组:用0.2ng/ml的rrGM-CSF（recombination rat GM-CSF,重组大鼠）培养DC;第二组:用5ng/ml的GM-CSF加5ng/L白细胞介素-4（recombination rat IL-4,rrIL-4）培养DC;第三组:rrGM-CSF+rrIL-4再加10ng/ml大鼠白细胞介素—10（recombination rat IL-10,rrIL-10）培养DC;用三种方法诱导的DC在第13天开始实验。三种方法获得的DC在表型和功能特点上互相对比。其次用负载抗原的DC及多烯紫杉醇处理肝癌细胞,根据对肝癌细胞的处理因素不同分为4组,分别为:DC组:观察负载抗原的DC对HepG-2肝癌细胞的杀伤作用;DOC组:观察多烯紫杉醇对HepG-2肝癌细胞的杀伤作用;联合组:观察负载抗原的DC联合多烯紫杉醇对HepG-2的杀伤作用;对照组:未加任何处理因素。四组用流式细胞术对凋亡细胞进行直观的数量检测,荧光染色在形态学角度观察肝癌细胞的细胞凋亡情况,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）观察肝癌细胞的细胞凋亡情况以及Western免疫印迹检测bcl-2蛋白的变化来反映肝癌细胞凋亡情况。第三,用负载抗原的DC及多烯紫杉醇处理裸鼠肝癌模型,根据对肝癌瘤体的抑制因素不同分为4组,每组6只裸鼠,7天注射一次干预因素,5天测量一次肿瘤大小,最后一次测量肿瘤的重量,分别为:DC组:观察负载抗原的DC对肝癌瘤体的抑制作用;DOC组:观察多烯紫杉醇对肝癌瘤体的抑制作用;联合组:观察负载抗原的DC联合多烯紫杉醇对对肝癌瘤体的抑制作用,先注射负载抗原的DC,然后注射多烯紫杉醇;对照组:观察未加任何干预因素,肝癌瘤体的生长状态。研究在体内被肝癌细胞融合疫苗激发的T淋巴细胞对接种到裸鼠身上的瘤体的细胞毒作用,同样研究多烯紫杉醇以及二者联合对瘤体的细胞毒性作用。通过检测接种瘤体的生长状态,免疫组化方法检测肝癌细胞凋亡和增殖情况,Western免疫印迹检测bcl-2蛋白在肝癌组织的表达情况来观察二者对肝癌瘤体的抑制作用。结果论文一中的第一组和第三组与第二组比,倒置显微镜显示第13天DC集落小,细胞较分散;电子显微镜显示细胞圆形,突起少。第二组倒置显微镜显示形成明显的集落,细胞周围有毛刺状突起;电子显微镜显示表面粗糙,细胞周围似有较多树枝状突起或裙褶状不规则突起使细胞表面呈现密集的绒毛状。培养第13天第一、二、三组DC表面表达OX62的比例分别为（79.4±5.7）%、（85.3±8.7）%和（79.6±4.6）%,每两组比较差异无显著性（P＞0.05）;表达CD86的比例分别为（13.5±2.1）%、78.3±11.6)%和35.4±5.2)%,第一组和第三组分别与第二组比较差异均有显著性（P＜0.05）。MTT检测第一组和第三组的DC不能有效刺激T细胞增殖,而第二组培养的DC有较强的刺激T淋巴细胞能力。第三组和第一组的刺激指数分别与第二组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。细胞增殖的量的方面第一组[（3.0±0.7）×106个]明显低于第二组[（13.0±1.1）×106]和第三组[（11.9±2.1）×106],差别有统计学意义（P＜0.05）。论文二中的MTT检测,靶细胞（hepG-2肝癌细胞）杀伤率在DC组分别为（12.1±1.9）%、（33.5±2.4）%、（70.0±3.4）%;DOC组分别为（13.5±2.1）%、（18.0±1.7）%、（39.6±1.8%）;联合组分别（68.2±4.3）%、（51.9±3.2）%、（62.5±3.9）%。与DC组和DOC组相比,联合组细胞杀伤率最高,有统计学差异（均为P＜0.01）。DC组中HepG-2肝癌细胞用PI单染,然后流式细胞仪检测,凋亡率是18.6±2.1%。在DOC组是19.0±2.0%,联合组是32.6±2.3%,对照组无凋亡表现。联合组与DC组和DOC组分别对比,其差异均具有显著性（P＜0.01）。应用Western免疫印迹方法检测HepG-2肝癌细胞中bcl-2蛋白的表达。在联合组的bcl-2的表达率比DC组和DOC组的bcl-2的表达率低得多,其差异明显。通过荧光染色方法检测凋亡细胞数目,PI单染的联合组的凋亡细胞数目要显著多于DC组和DOC组凋亡的细胞数目。论文三中的联合组对bcl-2表达的抑制在三组肿瘤是最明显的。肝癌瘤体体积检测显示,DC组、DOC组及联合组的抑制率分别是（40.6±3.4）%、（36.9±2.9）%和（60.0±3.0）%,联合组和DC组之间其差异具有显著性（P＜0.01）,在联合组与DOC组之间的差异同样具有显著性(联合组与其他两组比较均（P＜0.01）。应用Western免疫印迹技术检测bcl-2蛋白的表达显示,联合组标本的bcl-2蛋白的阳性表达比DC组和DOC组的表达明显低,差异显著。结论1、在IL-10和低剂量GM-CSF条件下培养的树突状细胞是未成熟的树突状细胞,而IL-4条件下培养的则是成熟的树突状细胞;在IL-4和IL-10的培养条件下,树突状细胞的增殖率明显高于低剂量的GM-CSF组。2、负载抗原的DC疫苗联合多烯紫杉醇在体外对肝癌细胞的杀伤作用明显优于二者单独应用,提示二者对肝癌细胞的杀伤作用在作用机理层面上可能存在互相促进的作用。3、负载抗原的DC疫苗联合多烯紫杉醇在体内对裸鼠肝癌模型的肝癌瘤块的抑制作用明显优于二者单独应用,对二者在抑制肿瘤过程中的相互促进作用进行了进一步的证明,所以二者的联合可能产生一种新的肝癌的治疗方案;