G蛋白偶联受体激酶的新底物Eps15的发现及其生物学功能研究

论文题目: G蛋白偶联受体激酶的新底物Eps15的发现及其生物学功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 马志海

导师: 李林

关键词: 信号减敏,酵母双杂交,蛋白质相互作用,磷酸化

文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）

发表年度: 2005

论文摘要: G蛋白偶联受体（G Protein-coupled Receptor, GPCR）是一个种类繁多、功能各异的受体家族,与其关联的诸多生命活动中包括神经活动、代谢、红细胞生成作用、炎症反应,以及包括视觉、嗅觉和味觉等感觉信号处理过程。GPCR在受到信号分子（激动剂）持续作用时,信号转导效应反而会消失或降低,该现象被称为“减敏作用”（Desensitization）。G蛋白介导的信号转导系统的快速减敏作用主要通过受体的磷酸化而阻断了G蛋白与受体的结合。G蛋白偶联受体激酶（G Protein-coupled Receptor Kinases,GRKs）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它们能够快速的对活化的（激动剂结合的）受体蛋白磷酸化,被GRKs磷酸化的受体对β-滞留蛋白（β-arrestin）具有靶向性,β-滞留蛋白与磷酸化的受体结合导致G蛋白与受体解偶联和受体的内吞,从而有效地降低细胞膜上的功能受体水平而完成了信号减敏。多年来,关于GRKs的研究形成了国际上相关领域的一个热点,一直以来相关研究主要集中于它们在GPCR减敏过程中的作用,而近年来随着一些非GPCR类底物的发现,譬如tubulin、synuclein、EGFR、和PDGFR等等,越来越多的证据表明GRKs还存在其他的生物学功能1。本论文的第一部分工作主要是寻找未知的GRKs相互作用蛋白质,从而为深入研究GRKs在GPCR减敏中的功能以及为探索GRKs新的功能寻找线索。我们通过酵母双杂交技术以GRK2为诱饵筛选小鼠脑cDNA文库,得到了63个阳性克隆,共6种cDNA。经进一步筛选和分析,最终得到了Eps15、Eps15R和COPI的β亚基三种可能的与GRK2相互作用的蛋白质。对以上三种蛋白质进行了进一步的体外实验分析,结果表明其中Eps15和Eps15R能够作为GRK2的底物被磷酸化,进一步增加了它们与GRK2之间在生理条件下存在功能关联的可能性。由于这两种蛋白质的结构及功能非常类似,我们选择了研究背景相对较清楚的Eps15为研究对象。我们测定了GRK2磷酸化Eps15的酶动力学常数,结果显示其Km值为0.42±0.19μM,Vmax值为4.8±1.4 nmol min-1mg-1。另外,对体外被GRK2充分磷酸化的Eps15的磷掺入进行化学计量分析,结果表明磷酸化位点在十个以上。通过质谱技术找到了其中的四个磷酸位点,但是突变后Eps15的磷酸化没有显著的变化。进一步研究发现,GRK2主要是通过其C端可变区的PH结构域与Eps15

论文目录:

引言

正文

1. GRK2 的新底物Eps15 的发现

1.1 材料与方法

1.2 结果

1.3 讨论

2. 对GRK2 磷酸化Ep515 的生物学功能的探索

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

总结

参考文献

发表文章

致谢

附录

发布时间: 2006-08-29

参考文献

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