论文摘要
背景和目的:缺血性心脏病（Ischemic heart disease,IHD）是由于冠状动脉循环改变引起冠状动脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害,其中最常见的原因是冠心病,约占90%。传统的治疗手段主要是重建血供,而不能修复损伤和坏死的心肌。近几年兴起的干细胞移植法通过再生血管与心肌组织,使人们看到了治疗IHD的希望。血管内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells, EPCs）是指具有特异性归巢于血管新生组织并能分化增殖为成熟内皮细胞（Endothelial cells, ECs）的一群干/祖细胞。研究发现EPCs参与出生后的内皮修复和血管新生过程,提示其在IHD中重要的治疗作用以及广阔的临床应用前景。高增殖潜能和缺血区定向归巢特性使EPCs成为缺血性心血管疾病治疗的良好种子细胞。正常情况下,骨髓中EPCs处于休眠状态,在损伤、缺血等因素作用下EPCs从骨髓释放到外周血循环或经人为移植到体内,归巢于特定器官或组织,并在局部分化、增殖形成内皮细胞和新生血管。研究显示,缺血性心脏病患者血液循环中的EPCs数量下降了近50%,迁移能力受损。因此移植高增殖活性的EPCs是理想的细胞补充治疗方法。目前,EPCs治疗IHD常用的移植途径主要有经皮冠状动脉内注射、心肌内注射及经心内膜注射等途径,以上途径创伤性较大,因此极大地限制了EPCs在IHD中的应用。此前研究认为,只有通过介入及有创的方法方能将细胞准确定位并高浓度聚集于缺血心肌,从而实现局部治疗。然而有研究报道,大部分心肌内注射的骨髓源性基质干细胞在4d后发生死亡,约60%经冠脉内注射的骨髓单核细胞（Marrow mononuclear cell, MMNC）被脾脏、肝脏摄取,心脏残留的细胞数量仅约10%。那么如何解决EPCs移植有创且效率低下的问题呢?这是能否将这种血管新生及细胞再生治疗方法广泛应用的一个关键问题。因此,急需寻找一种无创、有效且定向性好的EPCs移植方法。最近Zen等利用脉冲式治疗超声联合白蛋白微泡（Microbubbles） Optison,将骨髓单核细胞经外周静脉输入充血性心肌病（Congestive cardiomyopathy, CC）动物模型,结果显示超声辐照+微泡+细胞移植组实验动物心肌组织血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）表达水平比单纯静脉注射细胞组更高,其靶向性粘附能力显著高于单纯静脉移植细胞组,说明在超声波作用下微泡破裂能提高细胞移植的靶向能力进而可能更有效地实现细胞的靶向传输。本研究尝试利用超声联合超声造影剂（微泡）介导EPCs的无创、定向移植探索一种新方法,探讨在该传递系统介导下能否有效促进细胞靶向归巢,初步探索其治疗心肌梗死的可行性、有效性。方法:1.大鼠骨髓源性EPCs分离、诱导培养及鉴定:Ficoll密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓源性单个核细胞,接种于包被纤维连接蛋白的培养板中,在添加了一定浓度的VEGF（50ng/mL）、bFGF（5ng/mL）和ECF（10ng/mL）等生长因子的培养液中常规培养;倒置显微镜下动态观察细胞生长特性及形态学变化,绘制细胞生长曲线;流式细胞技术检测细胞表面抗原CD34和VEGFR-2的表达;免疫荧光染色法检测内皮细胞特异性分子标志vWF以及摄取乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）和结合荆豆凝集素-I（UEA-I）的特性。2.大鼠心肌梗死（Myocardial infarction, MI）模型的建立与评价:40只健康SD大鼠,结扎冠状动脉左前降支（Left anterior descending coronary artery, LAD）建立MI模型。建立模型之前和建模后1w,二维超声与M型超声观察梗死区室壁厚度、搏动幅度,M型超声与左心室Tei指数检测左心室功能。采用HE染色与Masson’s染色法评价模型的建立。3.诊断超声联合微泡经静脉移植EPCs治疗MI的有效性评价:将建模成功的42只模型大鼠随机分为三组:单纯EPCs组（n=15）、超声辐照（Ultrasound, US）+微泡（Microbubbles, MB）+EPCs组（n=15）、对照组（Normal sodium, NS） （n=12）。超声条件设置:Vivid 7超声诊断仪,3S探头,频率设定为5MHz,机械指数（Mechanical index, MI）1.3,作用时间8 min,采用触发条件,触发间期为1s。模型建立1w后分组治疗,对照组经尾静脉给予1ml NS,单纯EPCs组直接将细胞（1×106个混悬于1mlNS）经尾静脉缓慢注入,US+MB+EPCs组则先经尾静脉注入本科自制的超声造影剂“脂氟显”（稀释10倍后按1ml/kg剂量）,然后在1min内缓慢注入EPCs,注入微泡时启动超声。细胞移植治疗4w后,处死动物、取材,采用HE染色,观测并计数梗死区及周围区毛细血管密度（Capillary density, CD）、心肌组织与血管通透性改变;采用Masson’s染色测量计算心肌梗死面积;免疫组织化学检测梗死区CD34表达。M型超声心动图与Tei指数评价各组左心室功能。所有实验数据以均数±标准差（ x±s）表示,统计学处理采用单因素方差分析和配对t检验。所有统计计算由SPSS13.0软件完成,统计结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.大鼠骨髓源性EPCs培养及鉴定:细胞培养3d后可以观察到细胞增多增大,呈纺锤形或短梭形细胞,逐渐伸出伪足样突起。5d后细胞较前明显增多,7d后细胞数显著增加,呈内皮细胞特异性的条索样结构,呈集落样生长。随着培养时间的延长,细胞相互融合,首尾相连呈“铺路石”状。流式细胞技术检测细胞表面抗原CD34、VEGFR-2表达率分别为86.02 %和81.37%;免疫荧光染色检测显示所培养的细胞表达vWF,并具有摄取acLDL和结合UEA-I的能力。2.大鼠MI模型的建立与评价:成功建立MI模型29只,其余11只大鼠分别死于麻醉意外、呼吸衰竭和心力衰竭等原因。建模成功大鼠二维超声检查可以看到其左心室前壁变薄、运动减弱或消失;超声检测建模前后大鼠左心功能,差异有十分显著的统计学意义（P<0.01）。HE染色显示大量心肌细胞坏死,疤痕形成;Masson’s染色显示左心室前壁心肌梗死区被胶原纤维取代,染色呈蓝色。3.诊断超声联合微泡经静脉移植EPCs治疗MI的有效性评价:HE染色计数心肌内CD:US+MB+EPCs组CD为（25.3±12.2）个/视野,明显高于对照组（12.6±4.5）个/视野和单纯EPCs组（19.2±6.2）个/视野（两者P<0.01）。大鼠心肌梗死面积的测定结果显示对照组的梗死面积为（41.9±4.3）%,EPCs组梗死面积为（36.7±3.8）%,而US+MB+EPCs组梗死面积为（25.3±4.5）%,明显低于前两者（两者P<0.01）。免疫组织化学检测采用CD34显示各组血管,阳性呈棕黄色。US+MB+EPCs组阳性血管最多,分布密集,单纯EPCs组也可见较丰富的血管分布,而对照组的阳性血管最少。US+MB+EPCs组的左心室收缩功能FS测值（50.27±5.98）% ,高于对照组（30.24±9.35） %（P<0.01）和单纯EPCs组（41.60±8.0） %（P<0.05）。EF测值比较,US+MB+EPCs组（85.9±2.18）%高于对照组（61.94±14.06）%（P<0.01）,高于单纯EPCs组（76.84±9.45）% （P<0.05）。左心室Tei指数检测:US+MB+EPCs组（0.57±0.10）分别低于单纯EPCs组（0.66±0.08）（P<0.05）和对照组（0.83±0.13）（P<0.01）。结论:1.大鼠骨髓中单个核细胞可诱导分化为EPCs。VEGF、bFGF和EGF可促进EPCs的增殖分化。2.通过结扎大鼠LAD成功建立了稳定的MI模型。左心室Tei指数可作为评价心肌梗死后心功能的指标。3.诊断超声联合微泡介导经静脉移植EPCs可改善MI大鼠心功能。其机制可能与超声空化效应与机械效应通过增加局部血管通透性促使EPCs归巢心肌缺血区并分化形成血管内皮,促进血管新生有关。