神经生长因子cDNA在毕赤酵母中的克隆表达、活性测定

论文摘要

大约半个世纪前神经生长因子（Nerve Growth Factor ,NGF）首先在蛇毒中发现,后来又在鼠颌下腺中发现。当把鼠肉瘤组织移植到鸡胚后,人们发现中枢神经增大,在试图弄清这个作用的过程中,蛇毒中磷酸二酯酶被发现富含神经生长因子。一种组织-成年雄性大鼠颌下腺已经成为神经生长因子很好的来源,其它来源常见于豚鼠前列腺和牛的精液中,这些来源的相关性还不清楚。神经生长因子是神经营养因子家族的一员,它对中枢神经系统和周围神经系统生长和分化具有重要作用,而且对促进损伤神经元的再生,神经系统退行性疾病的防治,阻滞神经肿瘤生长,促进神经细胞分化等具有重要的临床应用价值。神经生长因子（Nerve Growth Factor ,NGF）单体呈伸长形,中部为两对扭曲的反向平行的β链,一端有三个发夹结构,另一端有富含半胱氨酸的模序,这个模序对稳定单体的构象具有重要作用,两个单体平行排列形成紧密的同二聚体,二聚体是 NGF 的活性形式。1985 年第一次报道了毕赤酵母的转化,自从醇氧化酶得到分离和克隆后,毕赤酵母已经成为生产外源蛋白重要表达系统,与其他真核表达系统相比,毕赤酵母拥有许多优点,不仅没有与细菌相关的内毒素问题,也不存在在动物细胞培养过程中生产蛋白时滤过性毒菌引起的蛋白污染。毕赤酵母可以在甲醇为唯一碳源的条件下生长,在醇氧2化酶的作用下,毕赤酵母可将甲醇氧化成甲醛和过氧化氢,在毕赤酵母中有两个基因 AOX1 和 AOX2 编码乙醇氧化酶,AOX1 受甲醇专一诱导且能高水平表达。当细胞以葡萄糖、甘油和乙醇为碳源时,不能检测到AOX1 的表达,而在以甲醇为唯一碳源时,该酶可达到细胞可溶性蛋白的30%以上。在毕赤酵母中,编码醇氧化酶的基因也被分离和克隆到,酵母作为一种外源蛋白表达系统,由于兼有原核和真核细胞表达系统的优点,正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。 本文用基因工程的方法,获得蛇毒神经生长因子 cDNA 的酵母表达系统,为此做了以下工作:1.设计合成一对特异引物,分别带有 SnaBⅠ和 NotⅠ的限制性内切酶的识别位点,以 pPIC9K-NGF（带有组氨酸标签）重组质粒为模板,用 PCR 方法扩增 NGF cDNA 片段。这样 NGFcDNA 的两侧就带有 SnaBⅠ和 NotⅠ的识别位点。2.用限制性内切酶 SnaBⅠ和 NotⅠ酶切 NGF cDNA 的 PCR 产物,将其插入到载体 pPIC9K 中相应的限制性内切酶位点,构建表达载体pPIC9K-NGF。3.将重组质粒 pPIC9K-NGF 转化入大肠杆菌 DH5α 中,经 PCR鉴定阳性转化子。4.以双脱氧末端终止法对克隆的 NGFcDNA 进行测序。5.通过电转化的方法将测序正确的阳性重组质粒 pPIC9K-NGF 转入毕赤酵母细胞 GS115 中。6.用 PCR 方法再次对转染菌筛选鉴定,确认 pPIC9K-NGF 已成功转染毕赤酵母 GS115。7.经重组质粒 pPIC9K-NGF 转化的毕赤酵母 GS115 在甲醇诱导下进行表达,表达产物经透析方法浓缩,经 Tricine SDS-PAGE 鉴定。8.运用鸡胚背根神经节法观察蛇毒神经生长因子在体外对鸡胚背根神经节（DRG）生长的影响。本文成功构建了表达重组质粒 pPIC9K-NGF,pPIC9K-NGF 成功转染毕赤酵母细胞 GS115,pPIC9K-NGF 目的蛋白在毕赤酵母中获得表

论文目录

• 一、论文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料
• （五） 方法
• （六） 结果
• （七） 讨论
• （八） 结论
• （九） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 正文
• （二） 参考文献
• 三、致谢