两种葡萄卷叶伴随病毒的基因克隆、原核表达及葡萄遗传转化体系的初步建立

论文摘要

葡萄卷叶伴随病毒（Grapevine leafroll-associated virus，GLRaV）-2和GLRaV-3是引起葡萄卷叶病（Grapevine leafroll disease，GLD）发生的两种比较重要的病毒。目前GLD的防治措施主要是使用无病毒苗木和选育抗病品种，病毒的检测是具体实施过程中的一个重要环节，其中，血清学方法具有灵敏、快速、适合大量样品检测等优点而被广泛应用于葡萄病毒检测中。然而，GLRaVs为韧皮部限制性病毒，在寄主植物中含量低，除GLRaV-2外均没有烟草寄主；另外，GLRaVs的复合侵染现象比较普遍，因此，利用提纯病毒粒子的方法制备特异性的抗体比较困难，而用原核表达系统表达的重组病毒蛋白制备抗体则克服了这个问题。借助于基因工程手段，利用病原获得抗病性（Pathogen Derived Resistance，PDR）进行抗病毒育种方法克服了传统育种方法中育种周期过长的局限性而成为一种有效的育种手段，其中，由病毒复制酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）基因介导的抗性在某些方面明显优于外壳蛋白（Coat protein，CP）基因介导的抗性已被成功应用到多个病毒的抗病性研究上，而有关由GLRaVs RdRp基因介导的抗性研究目前尚无报道。另外，葡萄遗传转化较困难，迄今为止仅在少数几个基因型中获得了转基因植株，因此，建立一个高效的葡萄遗传转化体系，是保证葡萄抗病毒育种顺利进行的上游工作。 本研究旨在克隆GLRaV-2 RdRp和GLRaV-3 RdRp和CP基因后进行原核表达获得大量的重组蛋白制备抗血清，为国内葡萄无病毒种苗培育和种苗调运的检验提供有效的检测手段；另外，构建GLRaV-2 RdRp基因的植物表达载体，利用农杆菌介导法进行转化烟草研究，以揭示GLRaV-2 RdRp基因介导的抗病机制，并为进一步的利用此策略进行葡萄抗病毒育种提供理论依据和技术策略；最后，分别以“红地球”、“黑奥林”“美鲁特”试管苗的叶片、叶柄和茎段为试材，通过培养基的筛选，建立葡萄有效再生培养体系，以及构建GLRaV-3野生型RdRp基因植物表达载体及转化烟草验证转入的基因的功能后，通过农杆菌介导的遗传转化方法，对以上三个品种进行初步转化，为培育葡萄抗病毒品种建立一个良好的技术平台。本研究主要结果如下： 1．从“二号大宛红”样品中克隆了GLRaV-3（GLRaV-3-EDH）的RdRp和CP基因。序列测定结果表明，GLRaV-3-EDH RdRp基因全长为1618bp（GenBank登记号为AY495340），推导其编码538个aa，CP基因全长942bp（GenBank登记号为DQ119574），推导其编码313个aa；GenBank Blast（nr）检索结果表明，该RdRp基因与已报道的美国分离物GLRaV-3-NY1 RdRp基因核苷酸与氨基酸序列相似性均在99％以上，氨基酸变异主要发生在N端；该CP基因序列与已报道的3个GLRaV-3分离物CP基因核苷酸序列相似性均在99％以上，与巴西的一个分离物相似性为93％；CP氨基酸序列多重比对结果表明，5个GLRaV-3分离物序列中共有20个位点发生变异，其中，GLRaV-3-EDH CP中没有变异位点。 2．从“品丽珠”样品中克隆了GLRaV-2（GLRaV-3-CF）的RdRp基因。序列测

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 研究的目的与意义
• 1.2 葡萄卷叶病研究进展
• 1.2.1 葡萄卷叶病的发生、分布及危害
• 1.2.2 葡萄卷叶病的病原及病毒的寄主范围
• 1.2.3 GLRaVs传播途径
• 1.2.4 GLRaVs的检测方法
• 1.2.5 GLD防治措施
• 1.2.6 GLRaVs的分子生物学
• 1.2.6.1 GLRaVs的分类及基本特性
• 1.2.6.2 GLRaVs的基因组结构特征及主要表达产物的功能
• 1.2.6.3 Closteroviridae成员基因表达策略
• 1.2.7 GLRaV-2研究进展
• 1.2.8 GLRaV-3研究进展
• 1.3 葡萄遗传转化研究进展
• 1.3.1 葡萄遗传转化途径
• 1.3.2 葡萄再生系统的建立
• 1.3.2.1 叶片、叶柄、茎段再生培养
• 1.3.2.2 花药再生培养
• 1.3.3 影响葡萄遗传转化的因素
• 1.4 植物病毒RdRp基因介导的抗病性研究进展
• 1.4.1 由RdRp基因介导的抗病性
• 1.4.1.1 全长RdRp基因介导的抗病性
• 1.4.1.2 由RdRp亚基介导的抗病性
• 1.4.1.3 由缺失或突变的RdRp基因介导的抗病性
• 1.4.2 RdRp基因介导的抗病机制
• 1.4.3 展望
• 第二章 GLRaV-2 RdRp基因及GLRaV-3 RdRp和CP基因克隆与序列分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 植物材料及主要试剂
• 2.2.2 双抗体夹心ELISA（Double Antibody Sandwich ELISA,DAS-ELISA）
• 2.2.3 dsRNA提取
• 2.2.4 RT-PCR检测
• 2.2.5 引物设计与合成
• 2.2.6 基因克隆与序列测定
• 2.2.6.1 反转录合成第一链cDNA
• 2.2.6.2 PCR扩增
• 2.2.6.3 重叠延伸PCR扩增GLRaV-3全长RdRp基因
• 2.2.6.4 PCR产物的纯化与回收
• 2.2.6.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.6.6 质粒DNA的小量制备
• 2.2.6.7 质粒DNA的去磷酸化
• 2.2.6.8 PCR产物的克隆与测序
• 2.2.7 序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 GLRaVs的检测结果
• 2.3.1.1 收集材料的症状表现
• 2.3.1.2 DAS-ELISA检测结果
• 2.3.1.3 dsRNA提取及RT-PCR
• 2.3.2 GLRaV-3 RdRp基因的克隆与序列分析
• 2.3.2.1 GLRaV-3 RdRp基因的RT-PCR和重叠延伸
• 2.3.2.2 GLRaV-3 RdRp基因序列分析
• 2.3.3 GLRaV-3 CP基因的克隆与序列分析
• 2.3.3.1 GLRaV-3 CP基因的克隆
• 2.3.3.2 GLRaV-3 CP基因序列分析
• 2.3.4 GLRaV-2 RdRp基因的克隆与序列分析
• 2.3.4.1 GLRaV-2 RdRp基因克隆
• 2.3.4.2 GLRaV-2 RdRp基因序列分析
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 原核表达及相应抗血清的制备
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 质粒、菌株及主要试剂
• 3.2.2 原核表达载体的构建
• 3.2.2.1 GLRaV-2 RdRp基因原核表达载体的构建
• 3.2.2.2 GLRaV-3 RdRp基因原核表达载体的构建
• 3.2.2.3 GLRaV-3 CP基因原核表达载体的构建
• 3.2.3 原核表达及SDS-PAGE分析
• 3.2.3.1 原核表达
• 3.2.3.2 SDS-PAGE电泳
• 3.2.4 GLRaV-2 CP蛋白原核表达体系的改进
• 3.2.5 重组蛋白的大量制备、纯化及定量
• 3.2.6 抗血清的制备
• 3.2.6.1 免疫家兔
• 3.2.6.2 抗血清的收集和保存
• 3.2.7 间接ELISA（Indirect ELISA,ID-ELISA）测定抗血清的效价
• 3.2.8 Western blotting分析
• 3.2.9 制备的抗血清用于葡萄样品中的病毒检测
• 3.2.9.1 A蛋白ELISA（Protein A sandwich ELISA,PAS-ELISA）检测
• 3.2.9.2 斑点ELISA（Dot-blot immunobinding assay,Dot-ELISA）检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 原核表达载体构建
• 3.3.1.1 GLRaV-2 RdRp基因原核表达载体构建
• 3.3.1.2 GLRaV-3 RdRp基因原核表达载体构建
• 3.3.1.3 GLRaV-3 CP基因原核表达载体构建
• 3.3.2 原核表达及抗原性分析
• 3.3.2.1 GLRaV-2 RdRp基因在E.coli中的诱导表达
• 3.3.2.2 GLRaV-3 RdRp基因在E.coli中的表达
• 3.3.2.3 GLRaV-3 CP基因在E.coli中的表达及抗原性分析
• 3.3.2.4 用改进后的原核表达体系对GLRaV-2 CP基因进行原核表达
• 3.3.3 重组蛋白的浓度测定
• 3.3.4 ID-ELISA测定抗血清的效价
• 3.3.5 制备的抗血清的特异性测定
• 3.3.6 PAS-ELISA检测结果
• 3.3.7 Dot-ELISA检测结果
• 3.3.8 制备的抗血清用不同方法在病毒检测上的效果比较
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 GLRaV-2 RdRp基因植物表达载体构建及转化烟草研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 植物材料及主要试剂
• 4.2.2 植物表达载体的构建
• 4.2.2.1 以表达产生完整RdRp的cDNA植物表达载体的构建
• 4.2.2.2 缺失编码GDD保守基元序列的RdRp基因植物表达载体的构建
• 4.2.2.3 农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 4.2.3 烟草的转化、再生和筛选
• 4.2.4 Km抗性植株的PCR检测
• 4.2.5 抗性植株的Southern blotting分析
• 4.2.5.1 植物总DNA的大量提取
• 4.2.5.2 Southern杂交及检测步骤
• 4.2.6 转基因植株的Northern Blotting分析
• 4.2.6.1 植株总RNA提取
• 4.2.6.2 转基因植株的Northern杂交步骤
• 4.2.7 转基因植株的Western blotting分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 可以表达产生完整RdRp的cDNA植物表达载体的构建
• 4.3.2 缺失编码GDD序列的RdRp基因植物表达载体的构建
• 4.3.3 Km抗性烟草的获得
• 4.3.4 Km抗性烟草的PCR鉴定
• 4.3.5 Km抗性烟草的Southern杂交分析
• 4.3.6 转基因烟草的Northern blotting分析
• 4.3.7 转基因烟草Western blotting分析
• 4.4 小结与讨论
• 4.5 展望
• 第五章 葡萄遗传转化体系的建立
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 植物材料及主要试剂
• 5.2.2 葡萄再生体系的建立
• 5.2.2.1 叶片、叶柄和茎段再生培养的培养基配方
• 5.2.2.2 叶片、叶柄和茎段愈伤组织诱导和芽再生
• 5.2.2.3 花药再生培养的培养基配方
• 5.2.2.4 花药培养的材料处理方法及培养条件
• 5.2.3 GLRaV-3 RdRp基因植物表达载体构建
• 5.2.4 GLRaV-3 RdRp基因转化烟草及鉴定
• 5.2.4.1 转化烟草
• 5.2.4.2 Km抗性烟草的分子生物学鉴定
• 5.2.5 根癌农杆菌介导的葡萄遗传转化初步研究
• 5.2.5.1 Km敏感性实验
• 5.2.5.2 转化程序
• 5.2.5.3 不同处理方式对葡萄遗传转化效率的影响及葡萄遗传转化
• 5.2.5.4 Km抗性葡萄的PCR鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 葡萄再生体系的建立
• 5.3.1.1 叶片、叶柄和茎段愈伤组织诱导概况
• 5.3.1.2 不同葡萄外植体以及培养基对愈伤组织诱导效率的影响
• 5.3.1.3 从愈伤组织中分化出芽的情况
• 5.3.1.4 花药愈伤组织的诱导及分化
• 5.3.2 GLRaV-3 RdRp基因植物表达载体的构建
• 5.3.3 GLRaV-3 RdRp基因转化烟草及对Km抗性烟草的鉴定
• 5.3.3.1 Km抗性烟草的获得
• 5.3.3.2 Km抗性烟草PCR和PCR-Southern分析
• 5.3.3.3 转基因烟草的Northern boltting分析
• 5.3.4 葡萄遗传转化体系的初步建立
• 5.3.4.1 “红地球”不同外植体对Km的敏感性实验
• 5.3.4.2 不同因素对葡萄遗传转化效率影响
• 5.3.4.3 GLRaV-3 RdRp基因转化葡萄研究
• 5.3.4.4 Km抗性葡萄的PCR鉴定
• 5.4 小结与讨论
• 5.4.1 葡萄再生体系的优化
• 5.4.2 不同条件对葡萄遗传转化的影响
• 参考文献
• 附录Ⅰ：实验中用植物材料及来源
• 附录Ⅱ：主要试剂及溶液的配制
• 附录Ⅲ：博士在读期间已接受的文章及会议论文
• 致谢