论文摘要
目的:体外循环（cardiopulmonary bypass,CPB）诱发机体全身炎症反应（systemic inflammatory response,SIRS）,中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil,PMN）是人体对抗感染与异己物质的第一道防线,在机体防御机制中起着关键性的作用。炎症条件下,PMN大量激活,渗出后沉积于组织,造成周围组织损伤。凋亡是PMN从炎症部位非炎性清除的有效方式。因此,有效的治疗CPB-SIRS可以从适时适量的诱导PMN凋亡入手。但是,目前对CPB后凋亡的变化的研究较少,机制尚未清楚。本研究通过动态观察室间隔缺损修补术患儿在体外循环各时点静脉血中PMN的凋亡率,及其Fas、Bcl-2凋亡调控蛋白表达的变化规律,探讨CPB后PMN凋亡的变化及其分子生物学机制,为临床从PMN凋亡调控入手防治CPB引发的全身炎症反应提供实验室依据。方法:选择择期在体外循环下行室间隔缺损修补术的患儿30例（男13,女17）,年龄1～5岁,体重10～20kg,术前NYHA心功能分级均在Ⅰ～Ⅱ级,采用大剂量芬太尼和低浓度异氟醚全身麻醉,维库溴铵维持肌松。体外循环前应用3mg/kg肝素抗凝,全身肝素化后根据全血激活凝血时间（ACT）酌情追加,维持ACT>480s。CPB采用Sarns 8000型心肺机、儿童型膜式氧合器（国产希健-Ⅰ）、儿童型体外循环管道（科威）和儿童型动脉微栓过滤器（科威）进行体外转流。根据术前血常规检查结果,确定预充液的种类和容量,多采用6%羟乙基淀粉（贺斯）、复方乳酸钠林格氏液以及压积红细胞预充,并在CPB中使Hct维持在25%～30%,鼻咽温27～31℃,灌流量按2.2～2.8L·min-1·m-2体表面积计算,灌注压力维持在5080mmHg。心肌保护采用冷晶体停跳液进行主动脉根部灌注。转流中根据血气分析结果调节电解质。在撤离体外循环前,患儿鼻咽温度升至36℃。停CPB后,按1:12的剂量用硫酸鱼精蛋白中和肝素。术中均不用激素、抑肽酶、全血及超滤。分别于麻醉诱导后CPB前（T0）,CPB后30分钟（T1）,停CPB后30分钟（T2）,术后24小时（T3）共4个时点采取静脉血标本,采用Ficoll液密度梯度离心法分离中性粒细胞,瑞氏染色检验分离的细胞纯度,台盼兰检验细胞活性。将PMN用70%酒精固定18h后,用含0.1%Triton-X100和RNaseA酶的碘化丙啶（PI）避光染色,用流式细胞仪观察PMN凋亡率（AP%）。另外取各时点100μl全血加入藻红蛋白（PE）标记的Fas荧光单克隆抗体,溶血素裂解红细胞的干扰,同时用鼠抗人PE标记IgG2aκ作同型阴性对照,用流式细胞仪检测阳性细胞百分数。检测Bcl-2的表达时,将分离的PMN悬于含10%胎小牛血清的1640培养液中,置于5%CO2,37℃培养箱中培养24小时,破膜后加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Bcl-2荧光单克隆抗体,同时用鼠抗人FITC标记IgG2aκ作同型阴性对照,流式细胞仪检测阳性细胞百分数。应用SPSS10.0统计软件,计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。不同时点的数据进行重复测量数据的方差分析,两变量间的相互关系用直线相关分析。P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1体外循环转流持续时间52±17分钟,阻断升主动脉时间28±11分钟。所有病例均痊愈出院。2中性粒细胞凋亡率在CPB期间明显降低,与T0比较,在T2时点达最低值（1.79±0.57%）,差异有统计学意义（P<0.05）,T3时点恢复到CPB前水平（P>0.05）。PMN凋亡率最低值与CPB持续时间呈负相关（r=-0.648,P<0.05）。3与T0比较,PMN膜上Fas的阳性表达细胞百分数在T2、T3时点降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与T2比较,T3时点数值开始上升,差异有统计学意义（P<0.05）。Fas的阳性表达细胞百分数与PMN凋亡率最低值呈正相关（r=0.546,P<0.05）。4与T0比较,在T1、T2、T3时点PMN胞内Bcl-2的阳性表达细胞百分数升高,差异有统计学意义（P<0.05）。Bcl-2阳性表达细胞百分数与PMN凋亡率最低值呈负相关（r=-0.569,P<0.05）。结论:1. CPB触发全身炎症反应的过程中可导致中性粒细胞生存环境发生变化,产生的多种凋亡抑制因素使PMN凋亡受到抑制,从而PMN生存周期延长,PMN数目增加。2. Fas蛋白是一种细胞凋亡信号受体,CPB后的中性粒细胞凋亡延迟与Fas蛋白的表达下调有关。3. Bcl-2是Bcl-2蛋白家族中的一种抑凋亡蛋白,我们的研究显示CPB后的中性粒细胞凋亡延迟与Bcl-2蛋白的表达上调有关。