耐热酸性淀粉酶筛选及酶学特性研究

论文摘要

α-淀粉酶是一种重要的工业用酶,广泛应用于淀粉糖生产、发酵、纺织、造纸等行业中。由于工业上需要α-淀粉酶能在高温和酸性环境下水解淀粉,耐热酸性α-淀粉酶成了当前的研究热点之一。研究和开发耐高温酸性淀粉酶具有重要的经济价值和学术意义。本研究对杭州、山东、天津、陕西和云南等地各种土壤样品进行了大量筛选实验,从杭州双峰茶园的土样中筛选到一株耐高温酸性淀粉酶高产菌株,经16s rDNA鉴定为芽孢杆菌（Bacillales bacterium.）,命名为Bacillales bacterium.SF-8。对该菌株产生耐高温酸性淀粉酶的各种影响因子进行了研究,通过对发酵培养基和培养条件的优化,发酵液中淀粉酶活性最高达到6440 U/mL（60℃,pH 5.0）,比初始培养基提高了10倍。对该菌株产生的耐高温酸性淀粉酶酶学特性研究发现,该酶的最适pH为5.0,最适温度为60℃,在60℃环境下处理100 min后仍有66%酶活性,4℃环境中放置10天后仍有57%的活性。酶的热稳定性和活性对Ca2+没有依赖性,Fe2+,Mg2+,Mn2+等常见金属离子对酶活性没有明显的抑制作用。酶活性染色揭示该酶的分子量约为60 kD。薄层分析后发现其水解产物主要为麦芽糖和糊精。SF-8菌株产酸性α-淀粉酶活性高并且耐热性好,具有良好的工业应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 淀粉酶概述
• 1.1.1 淀粉酶分类
• 1.1.2 淀粉酶的工业应用
• 1.1.2.1 在淀粉工业中的应用
• 1.1.2.2 在造纸中的应用
• 1.1.2.3 在纺织退浆中的应用
• 1.1.2.4 在酒精工业中的应用
• 1.2.2.5 在啤酒酿造中的应用
• 1.2.2.6 在清洁剂中的应用
• 1.2 酸性α-淀粉酶概述
• 1.2.1 酸性α-淀粉酶的来源
• 1.2.2 酸性α-淀粉酶的作用机制
• 1.2.3 酸性淀粉酶的酶学性质特点
• 1.2.3.1 酸性α-淀粉酶的耐酸性
• 1.2.3.2 酸性α-淀粉酶的耐热性
• 1.3 耐酸性高温α-淀粉酶生产菌株育种
• 1.3.1 直接从自然界筛选
• 1.3.2 基因突变与诱变育种
• 1.3.3 遗传重组育种
• 1.3.4 基因工程与定向育种
• 1.4 选题的背景和意义
• 第二章 耐热酸性α-淀粉酶产生菌筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 土样
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 筛选方法
• 2.1.3.1 平板快速初步筛选步骤
• 2.1.3.2 摇瓶复筛步骤
• 2.1.4 酶活检测方法
• 2.1.5 菌种鉴定
• 2.1.5.1 形态观察和生理生化实验
• 2.1.5.2 16S rDNA的分子生物学鉴定
• 2.2 结果和讨论
• 2.2.1 平板初步筛选结果
• 2.2.2 摇瓶复筛的结果
• 2.2.2.1 淀粉标准曲线测定
• 2.2.2.2 摇瓶复筛的结果
• 2.2.3 酸性淀粉酶高产菌株SF-8菌种鉴定
• 2.2.3.1 菌体形态观测
• 2.2.3.2 SF-8菌16s rDNA鉴定
• 2.3 小结
• 第三章 产酶发酵条件优化及酸性α-淀粉酶酶学特性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 发酵条件对酶产量的影响
• 3.1.2.1 碳氮源浓度对酶产量的影响
• 3.1.2.2 接种量对酶产量的影响
• 3.1.2.3 发酵时间对酶量的影响
• 3.1.3 粗酶的分离纯化
• 3.1.4 酶的相关特性研究
• 3.1.4.1 酶活测定及酶活定义
• 3.1.4.2 酶反应的最适pH和最适温度测定
• 3.1.4.3 金属离子对酶活性的影响
• 3.1.4.4 酶的稳定性和热稳定性测定
• 3.1.4.5 酶分子量测定
• 3.1.4.6 酶促反应产物薄层分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 发酵条件对酶产量的影响
• 3.2.1.1 碳氮源浓度对酶产量的影响
• 3.2.1.2 接种量对酶产量的影响
• 3.2.1.3 发酵时间对淀粉酶产量的影响
• 3.2.2 粗酶的分离纯化
• 3.2.3 酶特性研究
• 3.2.3.1 酶反应的最适pH
• 3.2.3.2 酶反应的最适温度
• 3.2.3.3 金属离子对酶活性的影响
• 3.2.3.4 酶的稳定性和热稳定性测定
• 3.2.3.5 酶分子量的测定
• 3.2.3.6 酶促反应产物薄层分析结果
• 3.3 小结
• 第四章 酸性α-淀粉酶高产菌株SF-8基因组文库构建
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 主要药品和试剂
• 4.1.3 方法
• 4.1.3.1 酸性α-淀粉酶高产菌株培养
• 4.1.3.2 酸性α-淀粉酶高产菌株SF-8基因组DNA提取
• 4.1.3.3 菌株SF-8基因组DNA的纯化
• 4.1.3.4 菌株SF-8基因组DNA酶切
• 4.1.3.5 PUC19质粒提取和酶切
• 4.1.3.6 菌株SF-8基因组DNA去磷酸化
• 4.1.3.7 菌株SF-8基因组DNA与PUC19质粒连接转化
• 4.1.3.8 重组子转化
• 4.2 结果和讨论
• 4.3 小结
• 第五章 实验结果和展望
• 参考文献
• 致谢
• 研究生阶段发表论文情况