论文摘要
背景和目的:Livin是新近发现的凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein,IAP）成员之一,可以和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）直接结合起到凋亡抑制作用。Livin主要在胎盘组织中表达,在胎儿发育过程的多种组织中其表达量较高,而在正常人终末分化组织中呈低表达或不表达。研究发现在多数肿瘤组织中存在Livin高表达现象;它的过度表达可引起凋亡不足而与肿瘤发生密切相关;同时在肿瘤的化疗中,IAP的表达可以有效介导肿瘤的凋亡抵抗。近年来对Livin的研究表明,Livin有可能作为诱导肿瘤凋亡治疗的一个新靶点而倍受关注。肿瘤转移相关基因（metastasis associated gene,MTA）是一个不断快速增长的基因家族。现已发现该基因包含3类（MTA1,MTA2,MTA3）及6个亚型（MTA1,MTA1s,MTA-ZG29p,MTA2,MTA3,MTA3L）。MTA1被认为是细胞核重构和脱乙酰基复合物（nucleosome remodeling and histone deacetylase,NuRD）的组成部分之一,它通过影响染色质的状态来调整转录复制过程,调控组蛋白脱乙酰基从而发挥其生物学作用。目前多数研究认为MTA1的高表达与一些上皮源性肿瘤的侵袭转移密切相关。MTA1可能是通过参与信号传导与基因表达调控一系列有关浸涧转移的蛋白而起重要作用。MTA1基因的作用将为恶性肿瘤侵袭转移的调控提供一个有效的作用靶点和控制手段。在基因治疗方面,RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一个崭新的技术,它是由双链RNA引发的转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing,PTGS）现象。该技术能够有效使转录后基因沉默,甚至可以代替基因敲除,为高效特异地阻断致病基因表达提供了强有力的手段。已经有许多研究者们通过RNAi技术来干扰某些致病基因的表达使肿瘤的生物学行为发生一定程度的逆转。但肿瘤的发生与致病都是一个多因素和多基因参与的过程,往往只依靠解决单一的一种异常分子往往不能够完全达到预期的目的。鉴于凋亡抑制基因和肿瘤转移基因均是肿瘤发生以及肿瘤致死的主要因素,已经有学者利用RNAi技术沉默MTA1或Livin,并且取得了一定的肿瘤的抑制效果。有关MTA1和Livin基因在食管鳞癌组织中的表达以及在EC9706细胞诱导Livin和MTA1双基因沉默的实验研究,迄今国内外均未见报道。因此,本研究拟通过探讨:食管癌组织中Livin和MTA1基因的表达情况,及其与浸润转移的关系;构建Livin和MTA1双基因沉默慢病毒型siRNA载体,建立Livin和MTA1双基因沉默食管癌细胞模型;研究Livin和MTA1双基因沉默对食管癌细胞生长、凋亡、侵袭、转移等方面的作用;进而为食管癌靶向治疗提供理论和实验基础。本研究共分以下四个部分。第一部分:Livin、MTA1基因在食管鳞癌组织中的表达分析方法:收集45例食管癌手术标本,每例标本分别取癌灶及远端5cm处正常粘膜组织（即远癌正常组织）两部分。采用实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应（Real-time RT-PCR）分别检测食管癌组织和对应正常粘膜组织中Livinα、Livinβ和MTA1 mRNA的表达;同时采用免疫组化方法分析食管癌组织和对应正常粘膜组织中Livin和MTA1蛋白的表达。结果:1.45例食管癌组织中Livinα和Livinβ的mRNA相对表达量显著高于对应远癌正常组织中Livinα和Livinβ的mRNA相对表达量（P＜0.01）;食管癌组织中LivinβmRNA平均表达量高于LivinαmRNA,但差异无显著性（P＞0.05）。2.45例食管癌组织中Livin蛋白表达阳性率为95.6%（43/45）,对应远癌正常组织中Livin蛋白表达阳性率仅为6.7%（3/45）,二者差异有高度显著性（P＜0.01）。3.45例食管癌组织中MTA1 mRNA相对表达量显著高于对应远癌正常组织中MTA1 mRNA的相对表达量（P＜0.01）;有淋巴结转移标本中MTA1mRNA表达量显著高于无淋巴结转移标本,差异有高度显著性（P＜0.01）。4.45例食管癌组织中MTA1蛋白表达阳性率为55.6%（25/45）,对应远癌正常组织中却未见MTA1蛋白表达阳性表达。18例伴有淋巴结转移食管癌组织中MTA1蛋白的阳性表达率为100%（18/18）;而无淋巴结转移27例食管癌组织中MTA1蛋白的阳性率为25.9%（7/27）,两组问差别有显著性（P＜0.05）。第二部分:构建针对MTA1和Livin基因的siRNA载体及其沉默效果的分析方法:利用Takara、Ambion和Promega siRNA靶序列分析设计系统,扫描人MTA1 cDNA编码序列（NM-004689）和Livin cDNA编码序列（NM139317）,依据siRNA靶序列设计原则,经BLAST同源性分析,最终MTA1基因确定5个靶序列,Livin基因最终确定2个靶序列,同时随机组合出一条无关对照siRNA序列。分别合成8对编码短发卡RNA序列的DNA单链,两端分别加入BamHI和XhoⅠ的酶切残基。将合成的8对发卡DNA分别退火,分别克隆入siRNA载体（pRNAT-U6.2/Lenti）,通过PCR筛选和DNA序列分析,得到重组子pRNAT-U6.2/Lenti-M286、pRNAT-U6.2/Lenti-M481、pRNAT-U6.2/Lenti-M533、pRNAT-U6.2/Lenti-M1018、pRNAT-U6.2/Lenti-M1332、pRNAT-U6.2/Lenti-L440、pRNAT-U6.2/Lenti-L652和pRNAT-U6.2/Lenti-Con。与辅助包装质粒共转染293FT细胞,进行病毒包装;收集、纯化得到重组慢病毒颗粒。分别感染食管癌EC9706细胞,G418筛选得到稳定感染细胞株。分别用荧光定量RT-PCR和Western blot检测MTA1或Livin基因表达沉默效果。结果:1.筛选得到5个针对MTA1基因的siRNA靶序列,286-304nt,481-499 nt,533-551 nt,1018-1036 nt,1332-1350 nt;2个针对Livin基因的siRNA靶序列,分别为440-458 nt和652-470 nt。2.成功构建5个针对MTA1基因、2个针对Livin基因和1个无关序列慢病毒siRNA表达载体（pRNAT-U6.2/Lenti-M286、pRNAT-U6.2/Lenti-M481、pRNAT-U62/Lenti-M533、pRNAT-U6.2/Lenti-M1018、pRNAT-U62/Lenti-M1332、pRNAT-U62/Lenti-L440、pRNAT-U6.2/Lenti-L652和pRNAT-U6.2/Lenti-Con）,包装纯化得到重组慢病毒颗粒。3.经过G418筛选感染细胞,得到5株稳定感染沉默MTA1表达的EC9706细胞株（siM286、siM481、siM533、siM1018和siM1332）,得到2株稳定感染沉默Livin表达的EC9706细胞株（siL440和siL652）。4.感染靶向MTA1基因重组siRNA慢病毒的实验组食管癌EC9706细胞中MTA1 mRNA和蛋白表达都受到抑制,但抑制程度不同。其中pRNAT-U6.2/Lenti-M481包装产生的慢病毒,感染EC9706细胞的抑制效果最佳,MTA1mRNA和蛋白表达几乎完全抑制。5.感染靶向Livin基因重组siRNA慢病毒的实验组食管癌EC9706细胞中LivinmRNA和蛋白表达都受到抑制。pRNAT-U6.2/Lenti-L440包装产生的慢病毒,感染EC9706细胞的抑制效果强于pRNAT-U6.2/Lenti-L652,Livin表达几乎完全抑制。第三部分:RNAi干扰MTA1和Livin基因表达对食管癌EC9706细胞凋亡和侵袭迁移的影响方法:选用第二部分已构建出最有效沉默MTA1和Livin基因的siRNA载体,XhoⅠ和PmeⅠ双酶切pRNAT-U6.2/Lenti-Livin,回收XhoⅠ粘端和PmeⅠ平端线形化载体;AccⅡ和XhoⅠ酶切pRNAT-U6.2/Lenti-MTA1,回收475bp的MTA1siRNA单元:将MTA1 siRNA单元克隆入线形化pRNAT-U6.2/Lenti-Livin,经PCR筛选鉴定得到Livin和MTA1双基因沉默siRNA载体（pRNAT-U6.2/Lenti-Livin-MTA1）。与辅助包装质粒共转染293FT细胞,进行病毒包装;收集、纯化得到重组Livin和MTA1双基因沉默慢病毒颗粒。感染食管癌EC9706细胞,G418筛选得到稳定感染Livin和MTA1双基因沉默细胞株;荧光定量RT-PCR和Western-blot检测其沉默效果。对单一Livin基因沉默细胞株、单一MTA1基因沉默细胞株和Livin、MTA1双基因沉默细胞株,分别测定细胞生长曲线,Caspase-3活性,检测细胞凋亡和放射线敏感性的影响;测定细胞侵袭迁移能力。结果:1.构建出针对Livin和MTA1双基因沉默慢病毒siRNA载体pRNAT-U6.2/Lenti-Livin-MTA1,包装出Livin和MTA1双基因沉默慢病毒颗粒。2.筛选得到稳定Livin和MTA1双基因沉默的食管癌细胞株。3.Livin和MTA1双基因沉默慢病毒感染食管癌EC9706细胞,能够有效抑制细胞Livin和MTA1基因mRNA和蛋白的表达,与单一沉默Livin基因和MTA1基因的抑制效果相当。4.单一Livin基因沉默和Livin、MTA1双基因沉默,可使食管癌EC9706细胞生长速度显著减缓,凋亡率、Caspase-3活性和放射线敏感性显著增加,差异均有显著性（P＜0.05）。5.单一MTA1基因沉默和Livin、MTA1双基因沉默,可使食管癌EC9706细胞划痕愈合减缓和穿透胶能力降低。并且,Livin、MTA1双基因沉默细胞穿透胶能力降低的效果显著优于单一MTA1基因沉默细胞。第四部分:Livin和MTA1双基因沉默EC9706细胞裸鼠移植瘤的实验研究方法:用第三部分建立的Livin和MTA1双基因沉默EC9706细胞株作为实验组,以第二部分建立的无关siRNA对照食管癌EC9706细胞株作为无关siRNA对照组,用未感染的食管癌EC9706细胞株作为空白对照组。培养上述3种细胞,分别接种5周龄的雌性BALB/c裸鼠。测量肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线,28天后处死裸鼠,取肿瘤组织称重。荧光定量RT-PCR检测移植瘤组织中Livin、MTA1和PCNA mRNA的表达;免疫组化法检测移植瘤组织中Livin、MTA1蛋白的表达;流式细胞术检测移植瘤细胞的凋亡情况。结果:1.MTA1和Livin双基因沉默的食管癌EC9706细胞移植瘤,瘤体生长速度减慢。2.MTA1和Livin双基因沉默的食管癌EC9706细胞移植瘤平均重量为228.1mg,两个对照组分别为1265.6mg和1341.8mg,组间比差异有显著性（P＜0.05）。3.MTA1和Livin双基因沉默的食管癌EC9706细胞移植瘤细胞中PCNAmRNA表达量比两个对照组PCNA mRNA表达量显著降低,差异有显著性（P＜0.05）。4.MTA1和Livin双基因沉默的食管癌EC9706细胞移植瘤细胞凋亡率为12.75%,而2个对照组细胞凋亡率分别为1.53%和1.68%,差异有显著性（P＜0.05）。结论:1.食管癌组织中存在MTA1和Livin基因呈现高表达;MTA1基因表达与食管癌淋巴结转移密切相关。MTA1蛋白表达水平可能成为判断食管癌淋巴结转移的重要指标。2.成功构建出高效Livin和MTA1双基因沉默的慢病毒siRNA载体。3.筛选得到稳定Livin和MTA1双基因沉默的食管癌EC9706细胞株:Livin、MTA1单一基因沉默的食管癌EC9706细胞株。4.体外细胞实验证实,Livin和MTA1双基因沉默,可使食管癌EC9706细胞生长速度显著减缓,浸润和侵袭能力显著降低,肿瘤细胞凋亡率和放射线敏感性显著增加,并且效果优于单一基因沉默。5.裸鼠体内实验证实,沉默食管癌EC9706细胞MTA1和Livin双基因的表达后,可以有效的抑制移植瘤的生长,并且增加了肿瘤细胞凋亡。6.同时沉默Livin和MTA1基因的表达,有望成为食管癌靶向基因治疗的新方法。