苏云金杆菌4.0718菌株的cry杀虫基因和功能蛋白质组学研究

论文摘要

研究和发展现代植物保护生物技术，确保食品安全，保护生态环境和维护人类健康具有重要意义。近年来，利用苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）取代有残留杀虫化学农药控制植物害虫，实施生态农业计划，已成为国际上发展的新趋势。但在对提高Bt杀虫毒力、挖掘新的cry杀虫功能基因和研究其蛋白质组学上有待深入进行。本文利用微生物技术，分子生物学技术和蛋白质组学方法，选育出Bt4.0718新菌株，系统研究了cry基因，发现了新的杀虫基因，利用烟草几丁质酶基因tchi B与Bt4.0718菌株的cry1Ac基因重组，获得高效杀虫工程菌。首次对Bt的杀虫功能蛋白质组进行了研究。Bt作为微生物杀虫剂在生产上成功推广和应用，很大程度上取决于高毒力菌株的选育。本研究从湖南不同生态区域采集的858份土样中，分离出30份Bt菌株。从中筛选一株具有典型Bt菌落特征和较高杀虫毒力的7012c为出发菌株，经紫外线和两次亚硝基胍（NTG+LiCl）的交替复合诱变，发现菌体的伴孢晶体的形状、大小、数量和芽孢同伴孢晶体的比例与杀虫毒力密切相关。以此特征为依据进行快速初筛和毒力生测复筛，获得一株高毒力突变杀虫新菌株4.0718。该突变株杀虫毒力与出发菌株相比提高了7.5倍，在6h、12h、和24h内供试小菜蛾三龄幼虫死亡率分别高达20％、97％和100％。此菌株经连续10代培养稳定遗传。这为高毒力杀虫菌株的选育提供了一种简单和快速的方法。在对4.0718进行单因子培养条件试验的基础上，采用正交设计试验和结合杀虫毒力生测，对该菌株进行发酵试验，获得了最佳发酵条件。Bt菌株的杀虫活性与其携带的编码杀虫晶体蛋白（ICPs）的cry基因密切相关。通过PCR扩增的产物电泳检测，4.0718含有cry1和cry类杀虫基因，显示出4.0718菌株cry基因类型丰富。将4.0718菌株质粒上的cry1Ac基因和烟草几丁质酶基因tchiB（去掉信号肽和去信号肽再加肠激酶位点）重组，经双酶切和亚克隆，将带有cry1Ac基因上游启动序列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体pHT315中，分别构建重组质粒pHUAccB6和pHUAccB7，转入E.coli，电转入Bt无晶体突变株XBU001中，获得重组菌株HAccB6和HAccB7。通过液体双相孢晶分离提取后，将晶体和上清液分别进行SDS-PAGE分析，双价重组基因与对照cry1Ac基因在无晶体突变株中表达量相比较，获得高效表达的双价融合蛋白。经定量分析：双价融合蛋白分别占总蛋白量的62.5％；Cry1Ac蛋白占蛋白总量的42.0％。经原子力显微镜和电子显微镜观察，表达后的融合蛋白呈菱形和椭圆形晶体，其规格约为1.5×3.0μm。经生测分析，两株工程菌HAccB6和HAccB7的重组基因表达的融合晶体蛋白二者在毒力上比较接近，而与对照工程菌HAc5和野生菌4.0718相比较，速杀时间提前36h。工程菌HAccB6对棉铃虫（Heli coverpa armigera）具有高效杀虫活性，其72h LC50值为9.10μg／mL，为对照菌杀虫毒力的4.529倍。结果显示出tchiB基因与cry1Ac基因重组后的表达产物具有显著的杀虫增效作用。首次对Bt杀虫晶体蛋白质进行了研究。用液体双相法和等电点沉淀法纯化晶体蛋白，结合用2-DE分离的蛋白质进行质谱鉴定，确定了伴孢晶体蛋白总蛋白质的提取方法，获得了更清晰、分辨率更高和聚焦效果更好的2-DE图谱，建立了Bt晶体蛋白的双向电泳方法。对分别属于Bt的3个不同亚种的库斯塔克亚种4.0718、武汉亚种140菌株和以色列亚种H14菌株及相关工程菌株HAccB6和HAccB7的晶体蛋白质进行了系统的研究。工程菌HAccB6和HAccB7菌株分别检测到356±9和400±11个，其中两者129个蛋白质斑点相互匹配，平均匹配百分率为30％。等电点沉淀法双向电泳（2-DE）图谱中检测到90±9和193±11个蛋白质斑点数，其中两者的80个蛋白质斑点相互匹配，平均匹配百分率为40％，说明两者在毒力以及杀虫谱上的相似性和差异性。对2-DE胶上大部份蛋白质点进行了质谱分析，鉴定出各菌株的晶体蛋白成份中的7类功能蛋白质，即杀虫毒蛋白（Cry1Ac、Cry2Aa、CryIG，CryH2，Cry1Ab16，Cry2Ac2）、晶体形成相关结构蛋白（伴侣蛋白dnak）、蛋白质折叠和组装的重要调节者热休克蛋白HSP60，物质代谢酶类（分支链氨基酸转氨酶、烯醇酶、丙酮酸脱氢酶复合物E3）、蛋白质合成因子（ATP合成酶F1、ATP合成酶β-链、β-内酰胺酶、翻译延长因子Ts、Tu、G）、延长因子EF-Tu和EF-Ts、假想蛋白、转运蛋白（ABC transporter ATP-binding protein）、和蛋白引发因子（Trigger factor）等。从研究的Bt菌株中都鉴定有HSP-60，翻译延长因子Tu这两种蛋白，认为这两种蛋白很可能为晶体形成相关的重要蛋白，且杀虫晶体蛋白在结构与杀虫活性功能上的关系密切。这些表达谱和功能蛋白质组的研究将有助于对杀虫晶体蛋白杀虫机理的理解。特别是在Bt武汉亚种中新发现了Cry2Ac6蛋白。晶体蛋白种类的不同则有助于解释4.0718菌株高效杀虫的生化功能特征。结合利用CPHmodles、Ds ViewerProTrial和Swiss-Pdb Viewer软件，发现新型的Cry2Ac6与Cry2Aa的毒性核心片段空间结构有一定差异。说明与昆虫中肠受体蛋白结合的亲和力不同，引起其在杀虫毒力上的差异。总之，本项研究为苏云金芽孢杆菌高毒力杀虫菌株的选育、发酵条件、cry基因与外源毒素基因重组及亚种间功能蛋白质组学研究提供了一系列的方法和可借鉴的研究思路，鉴定了与杀虫毒力相关的cry基因及其功能蛋白质组，创新性研究了不同原毒素分子结构与杀虫活性之间的内在规律及其与昆虫细胞受体结合机制的信息。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thruingiensis,Bt）研究现状
• 1.1 苏云金芽孢杆菌研究的历史
• 1.2 苏云金芽孢杆菌的分类
• 1.2.1 血清学分类
• 1.2.2 杀虫晶体蛋白基因的分类、同源性与生物活性
• 1.3 杀虫晶体毒蛋白的结构与生物活性
• 1.3.1 伴胞晶体蛋白的形态和化学组成
• 1.3.2 杀虫晶体毒蛋白的高级结构
• 1.3.3 杀虫晶体蛋白作用机制
• 1.4 高毒力菌株的分离及新型杀虫基因的克隆
• 1.4.1 Bt微生物基因工程菌的构建
• 2 几丁质酶研究概况及在生物防治领域中的应用
• 2.1 几丁质酶的研究历史
• 2.2 几丁质酶杀虫增效作用
• 2.3 对害虫防治的增效机理
• 3 微生物蛋白质组学研究进展
• 3.1 蛋白质组学概述
• 3.2 蛋白质组学的技术进展
• 3.2.1 二维凝胶电泳和蛋白质分离分析技术
• 3.2.2 生物质谱与蛋白质鉴定
• 3.2.3 二维质谱新技术
• 3.2.4 多维色谱蛋白质鉴定技术
• 3.3 蛋白质组的应用研究
• 3.3.1 蛋白质的翻译后修饰
• 3.3.2 蛋白质之间相互作用特点
• 3.3.3 建立蛋白组数据库
• 3.4 微生物蛋白质组学的研究现状
• 3.4.1 培养条件改变的微生物蛋白质组学
• 3.4.2 微生物定量蛋白质组学
• 3.4.3 微生物亚细胞蛋白质组学
• 3.4.4 微生物基因工程蛋白质组学
• 3.4.5 微生物蛋白质组学与生物信息学的结合研究
• 3.5 蛋白质组技术在苏云金芽孢杆菌研究中的应用
• 第二章 苏云金芽孢杆菌高毒力菌株4.0718的快速选育及发酵条件的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 Bt4.0718菌株的选育
• 1.1.1 土样、菌株及试虫
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 诱变处理方法
• 1.1.4 初筛
• 1.1.5 复筛
• 1.1.6 毒力测定
• 1.2 Bt4.0718菌株的发酵条件
• 1.2.1 仪器与试剂
• 1.2.2 发酵培养条件试验表头设计
• 1.2.3 培养基氮的测定
• 1.2.4 培养基碳的测定
• 1.2.5 生物量测定和细胞学观察
• 1.2.6 发酵液的上清液和菌糊的制备
• 2 结果与分析
• 2.1 高毒力杀虫菌株4.0718的选育系谱
• 2.2 复合诱变后菌体涂片镜检初筛结果
• 2c复合诱变菌株毒力测定'>2.3 701^2c复合诱变菌株毒力测定
• 2.4 4.0718菌株的速杀效果
• 2.5 不同C/N比对4.0718菌株杀虫毒力的影响
• 2.6 不同pH、温度、培养时间的发酵菌液对杀虫毒力的影响
• 4）发酵菌液对杀虫毒力的影响'>2.7 不同接种量、装液量和激活剂（FeSO₄）发酵菌液对杀虫毒力的影响
• 2.8 上清液和菌体对杀虫毒力的影响
• 3 讨论
• 第三章 苏云金芽孢杆菌cry1Ac基因与烟草几丁质酶基因tchi B的双价基因融合表达及其杀虫增效作用
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基和培养条件
• 1.3 主要试剂和仪器
• 1.4 cry基因PCR引物设计
• 1.5 cry基因PCR分析
• 1.6 质粒DNA的分离和纯化
• 1.7 重组质粒的构建、转化及其稳定性检验
• 1.7.1 PCR扩增含有上游启动序列的cry1Ac基因
• 1.7.2 PCR扩增烟草几丁质酶基因tchiB
• 1.7.3 PCR扩增含有下游终止序列的cry1Ac基因
• 1.7.4 PCR扩增融合基因
• 1.7.5 融合基因表达载体的构建
• 1.7.6 融合基因表达载体电转化无晶体突变株XBU001及筛选
• 1.7.7 融合蛋白的分离提取和SDS-PAGE检测
• 1.8 原子力显微镜和扫描电子显微镜观察
• 1.8.1 原子力显微镜观察
• 1.8.2 扫描电子显微镜观察
• 1.9 供试昆虫和生物活性测定
• 2.0 序列测定
• 2 结果和分析
• 2.1 cry基因通用引物的特异性
• 2.2 4.0718菌株cry1和cry2特异基因型鉴定
• 2.3 融合基因的构建和鉴定
• 2.4 融合基因表达载体的构建
• 2.5 表达载体pHAccHB6、pHAccHB7电转化无晶体突变株XBU001
• 2.6 融合蛋白的分离提取和SDS-PAGE分析
• 2.7 原子力显微镜和扫描电子显微镜观察
• 2.7.1 原子力显微镜观察
• 2.7.2 扫描电子显微镜观察
• 2.8 生测分析
• 3 讨论
• 第四章 苏云金芽孢杆菌功能蛋白质组学研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株与培养条件
• 2.2 主要试剂和仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 伴孢晶体蛋白的分离
• 2.3.2 蛋白质含量测定
• 2.3.3 杀虫晶体蛋白的双向电泳
• 2.3.4 凝胶图像分析
• 2.3.5 蛋白质的原位酶解
• 2.3.6 MALDI-TOF肽质谱指纹图谱分析
• 2.3.7 质谱数据的数据库查询
• 2.4 Cry2Ac蛋白的三维结构分析
• 3 结果与分析
• 3.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体双向电泳条件的研究
• 3.1.1 优化晶体蛋白的裂解液配方
• 3.1.2 选取最适宜上样量
• 3.1.3 选用分离效果好pH胶条
• 3.1.4 摸索杀虫晶体蛋白提取方案
• 3.2 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质研究
• 3.2.1 苏云金芽孢杆菌亚种间杀虫晶体蛋白的比较蛋白质组研究
• 3.2.2 Bt程菌株的比较蛋白质组研究
• 3.2.3 蛋白质斑点的MALDI-TOF-MS肽质量指纹分析
• 4 讨论
• 4.1 2-DE图谱的获得与分析
• 4.2 部分蛋白质点的功能分析
• 4.3 Cry蛋白核心片断的结构特征分析
• 全文总结
• 1.结论
• 2.主要创新点
• 参考文献
• 附录
• 英文缩写与译名
• 致谢
• 作者简历
• 在读博士期间主要学术成果