兔腰大肌三聚磷酸盐水解酶的纯化及酶学特性研究

论文摘要

本试验从新西兰大白兔腰大肌中分离提纯肌球蛋白。通过两次调节离子强度,35-48%硫酸铵分级沉淀,DEAE-纤维素柱层析对粗酶液进行纯化。对纯化过程中蛋白液的三聚磷酸酶活性采用钼蓝比色法进行测定,研究发现粗酶液中比活力较低,仅为0.000374U/mg,通过两次调节离子强度去除部分杂蛋白后,比活力上升为0.003681U/mg,35—48%硫酸铵分级沉淀后,纯化倍数为13.5,最后经过DEAE-纤维素柱层析后纯化倍数为28,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证发现,纯化后的蛋白酶泳道条带为肌球蛋白的四种亚基条带,分别为一条220KDa的重链和三条分子量10-25KDa的轻链。由此可知,兔腰大肌肌球蛋白具有三聚磷酸酶活性。对兔腰大肌肌球蛋白三聚磷酸酶特性进行研究,三聚磷酸酶的活性测定采用钼蓝比色法,研究发现,兔腰大肌肌球蛋白三聚磷酸酶的最适pH为6.5,最适温度为35℃。Mg2+是三聚磷酸酶的激活剂,在Mg2+浓度为3mM左右有最佳激活效果。Ca2+对三聚磷酸酶也有激活作用,Ca2+浓度在0-6mM范围内时,三聚磷酸酶活性随Ca2+浓度的增加而增加,当Ca2+浓度大于6mM后,三聚磷酸酶活性趋于稳定。EDTA-Na2对三聚磷酸酶活性无显著影响。EDTA-Na4和KIO3对三聚磷酸酶具有抑制作用,且KIO3的抑制效果比EDTA-Na4好。本试验还研究了三聚磷酸酶的活性对兔腰大肌肌球蛋白流变学特性的影响。六偏磷酸盐处理的兔腰大肌肌球蛋白其流变学测定中的G′和G′’值明显大于焦磷酸盐和三聚磷酸盐处理样。六偏磷酸盐可以促进肌球蛋白分子间的交联,使肌球蛋白分子在较低温度下就聚集,而焦磷酸盐和三聚磷酸盐则会阻碍肌球蛋白的交联。当肌球蛋白中三聚磷酸酶被碘酸钾抑制后,其处理样的G′和G′’值更小。三聚磷酸酶被抑制的程度越大,三聚磷酸盐处理样的G′就越小。所以当三聚磷酸盐加入后,未被三聚磷酸酶分解成焦磷酸盐和正磷酸盐,而大部分以自身形式存在时会使肌球蛋白在较低温度下就开始聚集,但肌球蛋白分子间的交联度较小。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 文献综述
• 1 多聚磷酸盐在食品生产中的应用现状
• 2 多聚磷酸盐在食品生产中的作用
• 2.1 多聚磷酸盐的功能特性
• 2.2 多聚磷酸盐提高保水性的机理
• 3 食品中多聚磷酸盐的检测方法
• 3.1 钼蓝比色法
• 3.2 纸层析法
• 3.3 薄层层析法（TLC）
• 3.4 高效液相法（HPLC）
• 3.5 毛细管法（CE）
• 3.6 核磁共振法（NMR）
• 3.7 离子色谱法（IC）
• 4 多聚磷酸酶的研究现状
• 4.1 多聚磷酸盐水解的研究
• 4.2 多聚磷酸酶活性的影响因素
• 5 多聚磷酸盐水解与蛋白质功能特性的关系
• 6 本课题的立题依据、意义和研究内容
• 参考文献
• 第一章 兔腰大肌三聚磷酸盐水解酶的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 原料来源
• 1.1.2 试验试剂
• 1.1.3 试验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 兔腰大肌肌球蛋白的制备
• 1.2.2 DEAE柱层析
• 1.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.2.4 三聚磷酸酶活性的测定
• 1.2.5 钼蓝比色法
• 1.2.6 蛋白浓度的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 蛋白质标准曲线
• 2.2 磷标准曲线
• 2.3 DEAE-纤维素柱层析
• 2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第二章 兔腰大肌肌球蛋白三聚磷酸盐水解酶性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 原料来源
• 1.1.2 试验试剂
• 1.1.3 试验仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 兔腰大肌肌球蛋白三聚磷酸酶的制备
• 1.2.2 三聚磷酸酶活性测定方法
• 1.2.3 三聚磷酸酶性质的测定
• 1.3 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 初速率反应时间范围
• 2.2 最适pH
• 2.3 最适温度
• 2+对三聚磷酸酶活性的影响'>2.4 Mg²⁺对三聚磷酸酶活性的影响
• 2+对三聚磷酸酶活性的影响'>2.5 Ca²⁺对三聚磷酸酶活性的影响
• 2对三聚磷酸酶活性的影响'>2.6 EDTA-Na₂对三聚磷酸酶活性的影响
• 4对三聚磷酸酶活性的影响'>2.7 EDTA-Na₄对三聚磷酸酶活性的影响
• 3对三聚磷酸酶活性的影响'>2.8 KIO₃对三聚磷酸酶活性的影响
• 2.9 米氏常数
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第三章 三聚磷酸盐水解酶的活性对兔腰大肌肌球蛋白流变学特性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 原料来源
• 1.1.2 试验仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 兔腰大肌肌球蛋白制备
• 1.2.2 流变学的测定
• 1.2.3 不同种类的磷酸盐对蛋白质流变特性的影响
• 3存在条件下,三聚磷酸盐的水解对蛋白质流变特性的影响'>1.2.4 KIO₃存在条件下,三聚磷酸盐的水解对蛋白质流变特性的影响
• 1.3 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 不同种类的磷酸盐对蛋白质流变特性的影响
• 3存在条件下,三聚磷酸盐的水解对蛋白质流变特性的影响'>2.2 KIO₃存在条件下,三聚磷酸盐的水解对蛋白质流变特性的影响
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 全文结论
• 创新说明
• 致谢
• 在读期间发表的论文