精原干细胞移植制备转基因鸡的研究

论文摘要

精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是雄性成年动物睾丸内可自我复制的多潜能细胞,它能在体外分离纯化、培养、冻存及同体或异体移植,是能将自身遗传信息传给下一代的种质干细胞。本研究以鸡SSCs为实验材料,以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)为报告基因,比较了不同转染方法对鸡SSCs的转染效率,并对电穿孔转染条件进行了比较和优化;同时,通过细胞毒性敏感试验确立快速筛选转基因阳性细胞的G418(氨基糖甙类新霉素衍生物,Geneticin)适合浓度,进行体外快速筛选转染细胞的摸索,并尝试将筛选后的阳性SSCs和转染后未经筛选的SSCs植入经白消安处理去除生殖细胞的实验鸡体内,生精周期后采集精液,比较两者的转染效率,为利用SSCs介导生产转基因鸡提供参考依据。实验结果如下:1.采用磷酸钙转染法、脂质体转染法、电穿孔转染法等3种方法,对第2代鸡SSCs进行EGFP质粒转染。结果表明,电穿孔法转染率最高,为19.70%;脂质体转染法的转染率次之,为9.73%;磷酸钙转染法转染率最低,为2.92%。2.以EGFP为报告基因,电穿孔转染第2代鸡SSCs,比较电压、脉冲时程、质粒浓度、温度、细胞密度、细胞生长时期等因素对转染率的影响。结果显示:(1)当电压分别设置为170 V、220 V、270 V、320 V和370 V时,转染率分别为13.86%、16.80%、20.09%、19.72%和14.71%,转染率在270 V时最高,除320 V试验组外,与其它各组的转染率存在极显著差异(p<0.01);(2)当脉冲时程分别为40μs、60μs、80μs、100μs和120μs时,转染率分别为13.94%、19.22%、20.27%、13.44%和10.30%,转染率在80μs时最高,除60μs试验组外,与其它各组的转染率之间均存在极显著差异(p<0.01);(3)当质粒浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL时,转染率分别为9.35%、13.82%、20.32%和18.76%,转染率在质粒浓度为15μg/mL时最高,除20μg/mL试验组之外,与其它各试验组的转染率差异极显著( p<0.01);(4)当作用的温度分别为4℃、25℃和37℃时,转染率分别为21.81%、21.70%和10.13%,转染后放置在4℃和25℃中细胞的存活率和转染率均呈差异不显著关系(p>0.05),而这两个温度下的细胞存活率和转染率与放置37℃时的差异显著(p<0.05);(5)当细胞密度为1×104 /mL、1×105 /mL、1×106 /mL和1×107 /mL时,转染率分别为0.91%、2.64%、22.50%和22.08%,可见最适转染密度为1×106 /mL～1×107 /mL;(6)当转染细胞为对数期和平台期细胞时,对数期细胞的转染率是平台期细胞的两倍多,两组差异极显著(p<0. 01)。3.为了确定SSCs对G418的耐受能力,获得快速筛选SSCs的G418适宜浓度,本研究对SSCs进行了细胞毒性敏感实验。结果表明:SSCs分别在G418浓度为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL和1 000μg/mL的培养液中培养时,可存活时间分别为17 d、16 d、12 d、8 d、6 d、4 d、2 d、0 d、0 d和0 d。采用含有G418浓度为400μg/mL的培养基,对转染48 h的SSCs进行快速筛选,结果在筛选第6 d时,出现SSCs阳性克隆,筛选第8 d时,非阳性细胞全部死亡。4.实验组鸡按20 mg/Kg、25 mg/Kg、30 mg/Kg、35 mg/Kg、40 mg/Kg和45 mg/Kg的浓度梯度分别进行腹腔注射白消安,20 d后通过公鸡睾丸切片观察发现经浓度为20 mg/Kg,25 mg/Kg白消安处理的公鸡睾丸内部结构没有明显变化;经30 mg/Kg白消安作用的公鸡睾丸曲细精管结构遭到破坏,生精细胞明显减少,但未完全消除;35 mg/Kg白消安作用实验鸡20 d后,鸡睾丸曲细精管内生精细胞几乎消失完全,变成空网状,但白消安没有明显破坏睾丸间质结构;经40 mg/Kg白消安作用的公鸡,睾丸切片显示曲细精管内生精细胞消失完全,变成空网状,但睾丸间质结构部分被损伤;而45 mg/Kg白消安作用的公鸡睾丸曲细精管变成空网状,睾丸间质结构完全被破坏。可见最佳白消安作用浓度为35 mg/Kg.5.以EGFP为报告基因,电穿孔转染后,将筛选8 d的阳性细胞和转染后未经筛选的SSCs移植入经白消安处理的实验鸡体内。移植筛选细胞的鸡为实验组1,移植未经筛选细胞的鸡为实验组2。移植25 d后采集实验鸡精液发现,实验组1的鸡精液呈浅乳白色,粘稠度一般,精子密度为3.87(10~7 /ml),并经计算转染的成熟精子荧光表达率为4.25%;移植85 d时,精子密度为3.27(10~8 /ml),表达荧光阳性率为16.25%。移植25 d实验组2的鸡精液颜色较组1的更浅,粘稠度较低,精子密度为1.52(10~5 /ml),并经计算转染的成熟精子荧光表达率为2.68%;到移植85 d时,精子密度为2.11(10~6 /ml),表达荧光阳性率为10.71%。6.实验鸡移植25 d后,收集精液,提取DNA进行PCR扩增EGFP基因,经凝胶电泳检测,第1组鸡的精液DNA的条带清晰,与目的片段大小一致,第2组鸡中1只鸡的精液DNA扩增条带比较清晰,其余2只鸡的精液DNA扩增条带较浅。睾丸组织冰冻切片显示,曲细精管中生精细胞表达EGFP蛋白,但移植经过筛选的细胞的实验鸡曲细精管内生精细胞荧光表达较强。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 精原干细胞的研究背景及概况
• 1.1 鸡SSCs 的来源
• 1.2 鸡SSCs 的增殖和分化
• 1.3 鸡SSCs 的鉴定
• 2 鸡的睾丸组织解剖与组织学特点
• 3 转基因鸡的研究现状和进展
• 3.1 对输卵管、受精卵的操作
• 3.2 对胚胎细胞的操作
• 3.3 对胚盘的操作
• 4 基因转染技术
• 4.1 磷酸钙介导DNA 转染法
• 4.2 脂质体介导DNA 转染法
• 4.3 电穿孔介导DNA 转染法
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 实验部分
• 实验一 鸡胚精原干细胞体外转染 EGFP 基因及转染后的筛选
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 鸡胚精原干细胞培养液
• 1.4 仪器设备
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 饲养层的制备
• 1.5.2 鸡胚SSCs 分离、培养和传代
• 1.5.3 鸡胚SSCs 的鉴定
• 1.5.4 鸡胚SSCs 对G418 毒性敏感试验
• 1.5.5 pEGFP-N1 质粒的制备
• 1.5.6 3 种转染方法
• 1.5.7 转染率的观察与计算
• 1.5.8 转染细胞的筛选
• 1.5.9 数据处理
• 2 实验结果
• 2.1 鸡胚SSCs 的培养传代
• 2.2 鸡胚SSCs 的鉴定结果
• 2.3 鸡胚SSCs 对不同浓度G418 毒性的敏感性
• 2.4 质粒pEGFP-N1 的酶切鉴定
• 2.5 3 种转染方法转染精原干细胞的结果
• 2.6 电穿孔转染条件优化结果
• 2.7 转染细胞的筛选结果
• 3 讨论
• 3.1 不同转染方法结果
• 3.2 电穿孔转染条件的优化
• 3.3 转染后鸡SSCs 的筛选
• 实验二 白消安诱发建立鸡无精子症模型
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验模型建立
• 1.3 鸡存活情况和药物毒性观察
• 1.4 光镜形态学观察
• 1.5 鸡受精生育实验
• 1.6 统计方法
• 2 结果
• 2.1 死亡情况及毒性反应
• 2.2 公鸡睾丸切片形态学观察
• 2.3 公鸡精液光镜观测
• 2.4 公鸡受精结果检测
• 3 讨论
• 实验三 携带 EGFP 基因的精原干细胞移植
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 种蛋
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 转基因精原干细胞的获得
• 1.2.2 白消安诱导鸡无精子症模型
• 1.2.3 转染EGFP 的SSCs 移植
• 1.3 检测方法
• 1.3.1 精液涂片检测
• 1.3.2 精液基因组DNA PCR 检测
• 1.3.3 睾丸组织冰冻切片检测
• 1.4 统计方法
• 2 结果
• 2.1 白消安诱导鸡无精子症模型
• 2.2 精液涂片检测结果
• 2.3 精液基因组DNA PCR 产物琼脂糖检测结果
• 2.4 睾丸组织冰冻切片结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文