鹰嘴豆α-淀粉酶抑制剂的分离、鉴定及特性研究

论文摘要

α-淀粉酶抑制剂（α-amylase inhibitor, α-AI）属于一种糖苷水解酶抑制剂，广泛存在于植物种子的胚乳和微生物的代谢产物中，α-AI作为一种新型糖尿病治疗药物，以人体糖代谢的关键酶淀粉酶为作用靶点，抑制其生物活性，进而减少人体对食物中碳水化合物的消化吸收以及脂肪生成，起到降糖、降脂的作用。目前α-AI在医药和农业等领域有广泛的用途，特别是在临床上对糖尿病，高血糖，高血脂，脂肪过多症等疾病的治疗具有重要价值。另外，淀粉酶抑制剂提取物的疗效及安全性取决于加工和提取工艺，得到的抑制剂可被添加到食品中，用来增加糖尿病人的碳水化合物耐受量，降低摄取的能量，从而避免出现肥胖症。本文首次利用硫酸铵分级沉淀、阳离子柱交换以及Sephadex G-75凝胶过滤技术从鹰嘴豆（Cicer arietinum L.）种子中分离纯化得到α-淀粉酶抑制剂，并进行部分性质研究。鹰嘴豆种子经脱皮、碾磨、脱脂后，利用正交试验法对提取温度（A）、pH值（B）、提取时间（C）、溶剂用量（D）4个因素进行优化，确定α-AI粗提条件为在pH4.0，提取温度50℃，提取液体积比为1:35条件下浸提4.0h，其抑制活力最高。粗提液经35%65%饱和硫酸铵分步沉淀，进一步利用CM-52纤维素离子交换和Sephadex G-75分子筛层析，分离纯化得到其中的一种α-淀粉酶抑制剂（α-AI）。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，计算出该α-AI的分子量约为40.4kDa，对淀粉酶的抑制常数Ki为3.14×10-6mol·L-1（淀粉为底物时），最大半抑制剂浓度为1.03×10-6mol·L-1，是一种抑制活力很强的非竞争性抑制剂。鹰嘴豆α-AI的活性最佳孵化时间10min，最佳浓度为1.0×102μg·mL-1，在80℃加热30min，其抑制活性仍维持在85%左右，表明α-AI具有一定的耐热性。对pH值稳定性的研究表明，α-AI在pH值6.3附近时抑制活性最大，在pH3.011.0之间抑制活性相对稳定。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 α-淀粉酶抑制剂的概述
• 1.1.1 α-淀粉酶抑制剂的资源分布及类型
• 1.1.2 α-淀粉酶抑制剂的主要性质和特点
• 1.1.3 α-淀粉酶抑制剂的作用机理
• 1.1.4 α-淀粉酶抑制剂的活性测定
• 1.1.5 α-淀粉酶抑制剂生物活性的研究
• 1.1.6 α-淀粉酶抑制剂结构特征
• 1.1.7 α-淀粉酶抑制剂的研究概况和应用前景
• 1.1.7.1 在临床医学方面
• 1.1.7.2 在农业生产及植物保护方面的应用
• 1.1.7.3 在基因工程表达方面
• 1.2 糖尿病的概述
• 1.2.1 糖尿病的机理及治疗
• 1.2.2 国内外治疗糖尿病的研究
• 1.3 鹰嘴豆的概述
• 1.4 本课题研究的目的及主要内容
• 1.4.1 本课题研究的目的及意义
• 1.4.2 本论文研究的主要内容
• 1.4.3 本论文的创新点
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料、试剂及仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 蛋白质含量的测定
• 2.2.2 α-AI 活性的测定
• 2.2.3 α-AI 粗提物的制备
• 2.2.3.1 鹰嘴豆粉的制备方法
• 2.2.3.2 浸提液最适体积的确定
• 2.2.3.3 浸提液最适 pH 值的确定
• 2.2.3.4 浸提液最适提取时间的确定
• 2.2.3.5 浸提液最适温度的确定
• 2.2.3.6 α-AI 粗提条件的正交试验优化设计
• 2.2.4 α-AI 的分离纯化
• 2.2.4.1 硫酸铵分级沉淀条件的确定
• 2.2.4.2 离子交换层析和凝胶过滤层析的应用
• 2.2.5 α-AI 性质鉴定
• 2.2.5.1 α-AI 分子量测定
• 2.2.5.2 α-AI 热稳定性分析
• 2.2.5.3 鹰嘴豆α-AI 对 pH 的稳定性
• 2.2.5.4 α-AI 的最佳孵化时间的确定
• 2.2.5.5 鹰嘴豆α-AI 浓度对其活性的影响
• 2.2.5.6 α-AI 的抑制动力学实验
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 鹰嘴豆α-AI 粗提物的制备
• 3.1.1 浸提液最适体积的确定
• 3.1.2 浸提液最适 pH 值的确定
• 3.1.3 浸提液最适提取时间的确定
• 3.1.4 浸提液最适提取温度的确定
• 3.1.5 鹰嘴豆α-AI 粗提条件的正交优化
• 3.2 鹰嘴豆α-AI 的分离纯化
• 3.2.1 硫酸铵分级沉淀
• 3.2.2 CM-52 纤维素离子交换层析
• 3.2.3 G-75 凝胶过滤层析的应用
• 3.3 鹰嘴豆α-AI 的部分性质鉴定
• 3.3.1 α-AI 分子量的测定
• 3.3.2 α-AI 的热稳定性分析
• 3.3.3 α-AI 对 pH 值的稳定性
• 3.3.4 孵化时间对α-AI 抑制剂活性的影响
• 3.3.5 α-AI 抑制剂浓度对其活性的影响
• 3.3.6 α-AI 抑制类型和抑制常数 Ki值的确定
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢