甘蔗花叶病毒E株系CP基因原核表达与抗体制备

论文摘要

甘蔗是最重要的糖料作物,占我国食糖产量的90%以上,同时它也是南方地区生产燃料乙醇的最佳可再生能源作物。甘蔗花叶病毒（sugarcane mosaic virus,ScMV）引起的甘蔗花叶病是我国和世界甘蔗生产中最主要的病害之一,造成产量下降、品质变劣和品种种性退化,培育和栽培抗病品种是最有效的措施,其次是利用脱毒健康种苗,与带毒供体相比,增产幅度可达30%以上。尽管传统有性杂交仍是目前培育甘蔗抗病品种最普遍采用也是最有成效的方法,但是,利用基因工程技术改良甘蔗品种已成为有效的高新技术途径。 在国家“十五”863项目（2002AA241031）和农业部948项目（2003—Q06）项目的资助下,农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室开展了甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白基因（ScMV-ECP）转化甘蔗研究,并已获得一批获准进行中间试验的转基因甘蔗,有关转基因甘蔗特异蛋白的时空表达情况和表达量研究均需要高度特异的抗体。另一方面,脱毒健康种苗的生产和应用也需要快速、灵敏的检测技术作为支撑,抗体免疫技术无疑可满足该技术的要求。基于此,本研究以ScMV-ECP基因为外源目的基因,通过构建原核表达载体转化原核生物EscherichiacoliBL21（DE3）,获得该基因的特异表达蛋白,再以其作为免疫原制备多克隆抗体。主要结果如下: （1） 根掘ScMV-ECP基因的序列和原核表达载体的酶切位点,设计两条分别带有BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的引物,以带有甘蔗花叶病毒E株系CP基因的质粒pNUSCP为模板,利用PCR方法扩增获得一个长度与ScMV-ECP基因完整片段相当的特异性片段。回收并纯化该片段,并连接到克隆载体pMD18-T Simple Vector上,转化E.coli菌株DH5a,利用氨苄青霉素筛选抗性菌落,PCR和酶切鉴定拟转化子。 （2） 采用内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ同时消化转化子pMD18-T-CP质粒

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 一、前言
• 1、甘蔗花叶病和甘蔗花叶病毒的研究背景与现状
• 1.1 甘蔗花叶病的发生及危害
• 1.2 甘蔗花叶病毒
• 1.2.1 甘蔗花叶病毒的归属和特征
• 1.2.2 甘蔗花叶病毒亚组分类
• 1.2.3 我国甘蔗花叶病毒的株系和分化
• 1.3 甘蔗抗花叶病育种研究现状
• 2、甘蔗抗病毒基因工程
• 2.1 甘蔗抗病毒基因工程的主要策略
• 2.1.1 基于外壳蛋白基因
• 2.1.2 其它方面
• 3、甘蔗花叶病毒E株系的抗体制备与应用现状
• 4、本项目研究的目的和意义
• 二、材料和方法
• 1、实验材料
• 1.1 供试的菌株与质粒
• 1.2 引物
• 1.3 工具酶和试剂盒
• 1.4 其它试剂
• 1.5 实验动物
• 1.6 主要仪器设备
• 2、实验方法
• 2.1 基本分子生物学方法
• 2.2 甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因的扩增和回收
• 2.2.1 质粒pNUSCP少量提取及纯化
• 2.2.2 ScMV-E CP基因部分片段PCR扩增
• 2.2.3 目的片段回收和纯化
• 2.3 ScMV-E CP基因的亚克隆
• 2.3.1 目的片段与克隆载体连接
• 2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.3 转化大肠杆菌DH5a
• 2.3.4 拟转化子的鉴定
• 2.4 ScMV-E CP基因的原核表达载体构建
• 2.4.1 pMD18-T-CP质粒的双酶切和目的片段回收
• 2.4.2 原核表达载体pEi29a（+）的提取及纯化
• 2.4.3 原核表达载体pET29a（+）的双酶切和回收
• 2.4.4 目的片段与表达载体的连接
• 2.4.5 转化大肠杆菌DH5a
• 2.4.6 原核表达载体拟重组质粒的鉴定
• 2.5 ScJIF-E CP基因的原核表达
• 2.5.1 大肠杆菌BL21（DE3）的感受态制备
• 2.5.2 转化大肠杆菌BL21（DE3）
• 2.5.3 目的蛋白的诱导表达
• 2.5.4 在不同诱导时间下目的蛋白的表达量
• 2.6 SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白
• 2.6.1 表达菌的裂解
• 2.6.2 SDS-PAGE凝胶电泳
• 2.6.3 硝酸银染色
• 2.7 目的蛋白的纯化
• 2.7.1 天然条件下样品的制备
• 2.7.2 柱的准备
• 2.7.3 表达蛋白的纯化
• 2.8 多克隆抗体制备与保存
• 2.9 ScMV-E CP抗血清效价测定
• 2.10 抗血清特异性评价
• 三、结果和分析
• 1、甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因（SCMV—E CP）的扩增和回收
• 1.1 目的片段ScMV-E CP的PCR扩增结果
• 1.2 目的片段回收纯化的结果
• 2、ScMV-E CP基因亚克隆转化子的鉴定结果
• 2.1 PER鉴定亚克隆拟转化子
• 2.2 双酶切鉴定亚克隆拟转化子
• 3、ScMV-E CP基因的原核表达载体构建
• 3.1 质粒pMD18-T-CP双酶切和目的片段回收结果
• 3.2 表达载体pET29a（+）的酶切和目的片段回收结果
• 3.3 原核表达拟重组质粒pET29a-CP与分子鉴定结果
• 3.4 序列测定及分析结果
• 4、ScMV-E CP基因的原核表达
• 4.1 SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白
• 4.2 诱导时间对目的蛋白的表达效应
• 5、纯化目的蛋白的检测
• 6、多克隆抗体
• 6.1 ScMV-E CP抗血清效价测定结果
• 6.2 抗血清特异性评价结果
• 四、讨论
• 1、关于甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因（ScMV-E CP）的扩增和回收
• 2、关于ScMV-CP基因克隆
• 3、关于原核表达载体的构建和表达
• 4、关于目的蛋白的纯化
• 5、关于多克隆抗体
• 6、本研究的创新以及进一步研究工作计划
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢