Dof家族中与氮胁迫相关基因的鉴定及其转基因水稻培育

论文摘要

水稻是最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以之为主食。氮在水稻生长发育过程中起着重要作用。然而，水稻的氮素吸收率较低。为了提高水稻产量，人们往往过量施用氮肥，这样不仅增加了农业成本，而且破坏了生态环境。转基因技术为提高水稻氮肥吸收效率，减少氮肥施用量提供了一条有效途径。本研究是通过对具有耐低氮功能的玉米Dof1进行同源分析，分别在水稻和拟南芥Dof家族中找到高度同源的基因；通过Northern检测水稻Dof家族在粳稻合江19低氮胁迫材料中的表达谱，筛选水稻Dof家族中对低氮有应答的基因；分别构建超表达载体，采用农杆菌介导法转化水稻，对获得的转基因植株进行分子检测和功能研究。主要结果如下：1、通过生物信息学Blast分析，选择与玉米Dof1同源性较高的拟南芥Dof转录因子At2g37590（gi：145360721）为目标基因，构建hpt和bar两种不同选择标记基因的超表达载体，分别命名为p13at和p33at；采用农杆菌介导法转化水稻恢复系明恢86，分别得到19株和2株阳性植株。2、通过生物信息学Blast分析得到与玉米Dof1同源性较高的水稻Dof转录因子OsDof-6（gi：19925962）；通过Northern检测水稻Dof家族在粳稻合江19低氮胁迫材料中的表达谱，筛选到对低氮胁迫有应答的水稻Dof转录因子OsDof-13（gi：19924314）；分别构建超表达载体，采用农杆菌介导法转化粳稻合江19，分别得到46株和52株阳性植株。3、亚细胞瞬时表达定位分析结果显示At2g37590、OsDof-6和OsDof-13均定位于细胞核。4、酵母单杂交试验结果表明：At2g37590与PEPC、IDH启动子区域有相互作用，但是OsDof-6和OsDof-13与PEPC、IDH启动子区域没有相互作用。5、通过Southern杂交对OsDof-13 T0代转基因植株进行了拷贝数的检测，外源片段以1-4个不等的拷贝数插入水稻基因组。6、通过Northern和Southern杂交对At2g37590 T0代转基因阳性植株进行了拷贝数检测和表达量检测，对At2g37590超表达的4个家系的T1代阳性植株的水培结果显示：全氮营养情况下，转基因株系在干物重、氮含量方面比野生型有提高。低氮营养情况下，转基因株系的每克干物质中氮含量比野生型提高了7.56％以上。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 氮素研究概述
• 1.1.1 氮的生理功能
• 1.1.2 氮素的吸收和转运
• 1.1.3 氮素同化
• 1.1.3.1 硝酸还原阶段
• 1.1.3.2 氨同化阶段
• 1.1.4 碳氮代谢的的相互作用
• 1.1.5 植物体内光合碳代谢和氮代谢之间的协调
• 1.1.6 氮素同化的基因工程策略
• 1.2 DOF（DNA BINDING WITH ONE FINGER）转录因子家族
• 1.2.1 Dof蛋白的结构
• 1.2.2 与Dof蛋白结合的DNA序列特异性
• 1.3 研究目的与意义
• 2.材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 受体植物材料
• 2.1.2 菌株、质粒及外源片段
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 候选基因的选定和分离
• 2.2.1.1 候选基因OsDof-6的选定
• 2.2.1.2 候选基因OsDof-13的选定
• 2.2.1.3 候选基因At2g37590的选定和克隆
• 2.2.2 亚细胞定位
• 2.2.2.1 亚细胞定位载体的构建
• 2.2.2.2 粒子轰击和GFP观察
• 2.2.3 酵母单杂交
• 2.2.3.1 酵母单杂交载体的构建
• 2.2.3.2 共转化酵母细胞
• 2.2.4 植物超表达载体的构建
• 2.2.5 农杆菌介导的水稻的遗传转化
• 0代转基因植株的阳性检测'>2.2.6 T₀代转基因植株的阳性检测
• 0代转基因植株的拷贝数检测'>2.2.7 T₀代转基因植株的拷贝数检测
• 1代单株干重和氮含量分析'>2.2.8 T₁代单株干重和氮含量分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 OsDof-6的序列分析
• 2.3.2 OsDof-13的低氮诱导表达分析和序列分析
• 2.3.3 At2g37590的序列分析
• 2.3.4 OsDof-6和OsDof-13以及At2g37590的亚细胞定位
• 2.3.4.1 亚细胞定位载体的鉴定
• 2.3.4.2 GFP的观察
• 2.3.5 OsDof-6和OsDof-13以及At2g37590与PEPC和IDH启动子的互作
• 2.3.5.1 酵母单杂交载体的鉴定
• 2.3.5.2 共转化酵母细胞
• 2.3.6 植物超表达载体的鉴定
• 2.3.7 农杆菌介导水稻的遗传转化
• 0代转基因植株的阳性检测'>2.3.8 T₀代转基因植株的阳性检测
• 0代转基因植株的拷贝数检测'>2.3.9 OsDof-13T₀代转基因植株的拷贝数检测
• 0代转基因植株的Northern blotting检测'>2.3.10 At2g37590T₀代转基因植株的Northern blotting检测
• 1代单株干重和氮含量分析'>2.3.11 At2g37590T₁代单株干重和氮含量分析
• 2.3.12 结果分析
• 3.讨论
• 0代AT2G37590的表达量与T₁代单株干重的关系的探讨'>3.1 T₀代AT2G37590的表达量与T₁代单株干重的关系的探讨
• 3.2 A-酮戊二酸可能是碳氮平衡的信号分子
• 3.3 试验中的个人体会
• 3.3.1 关于组培工作
• 3.3.2 水培试验中的注意事项
• 3.3.3 关于植株氮含量的测定
• 3.4 功能验证试验中低氮值的设定
• 3.5 关于AT2G37590后继功能验证试验的设想
• 3.6 植物营养研究的基因工程策略
• 参考文献
• 附录
• 致谢