拟南芥NH4+超敏突变体hsn1分子机制的相关研究

论文摘要

通过筛选EMS诱变的拟南芥（Col-0）突变体库,获得一个对NH4+超敏的突变体hsn1（hypersensitive to NH4+1）。利用图位克隆的方法,克隆到该突变基因为AtGMP1,并依据所克隆的基因测定了突变体和野生型体内的GDP—甘露糖焦磷酸化酶酶活,维生素C含量和蛋白糖基化水平。研究了突变体以及野生型体内的UPR和细胞死亡情况,结果如下:1.在含有NH4+的1/2 MS培养基条件下,突变体主根的生长相比野生型受到了严重阻碍,突变体主根构型受到严重破坏。生长于不含有NH4+的SN培养基上,突变体的症状被回复。由此表明突变体所表现出的生长缺陷与NH4+有关。植物体内NH4+浓度测定分析表明,生长在1/2 MS或SN培养基上,野生型和突变体体内的NH4+含量都无明显差异。但是当生长在1/2 MS培养基上时,野生型和突变体体内的NH4+含量明显高于生长在SN培养基上的。说明突变体生长在1/2 MS培养基上时生长受抑可能是由于突变体对NH4+含量的增加比较敏感。2.通过与Landsberg erecta（Ler）的杂交F2群体的遗传分析,确定该突变属于单基因隐性突变。利用SSLP分子标记对1056株突变体的连锁分析,确定了第2条染色体的H13和H16之间约129kb范围。候选基因分析确定了GDP—甘露糖焦磷酸化酶AtGMP1的单碱基突变。等位突变体和转基因回复试验进一步证明了GDP—甘露糖焦磷酸化酶AtGMP1的单碱基突变是造成突变体表型的原因。通过对野生型和突变体体内的GMP酶活的测定,突变体体内的GMP酶活低于野生型,并且GMP酶活是和植物体内的NH4+浓度相关的,NH4+的浓度越高,GMP的酶活越低。野生型GMP蛋白和突变的hsn1蛋白在三种pH条件下酶活测定的试验结果也证明了这个观点。3.野生型和突变体体内的维生素C含量检测和突变体vtc4-KO的生长试验的结果表明,突变体内维生素C含量的下降并不是造成突变体对NH4+超敏的主要原因。通过检测植物体内的蛋白质N糖基化水平,我们发现突变体地下部的蛋白质N糖基化水平下降,当培养基中NH4+存在时下降的更加严重。PDI的检测也暗示了培养基中NH4+存在时,野生型地下部的蛋白质N糖基化水平下降,虽然没有突变体下降的严重。因此,植物体内蛋白质N糖基化水平的下降是造成突变体表型的主要原因。4.通过对突变体和野生型体内未折叠蛋白反应（UPR）和细胞死亡的分析,我们发现当生长在含有NH4+的培养基上时,突变体体内UPR激活,细胞死亡产生。野生型中虽然没有突变体那么严重,但是体内UPR也激活,细胞死亡也产生了。上述研究结果表明,NH4+能抑制植物体内的蛋白质糖基化水平,激活植物体内的UPR和细胞死亡,当GDP—甘露糖焦磷酸化酶突变时,这种现象被加剧,影响植物正常的生长发育。这也为我们研究植物的NH4+毒害现象开辟了新的思路。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 4⁺对植物根系生长和发育的作用'>1.NH₄⁺对植物根系生长和发育的作用
• 1.1.氮（N）源对植物根系生长和发育的作用
• 1.2.铵毒害
• 1.2.1.铵毒害的表型
• 1.2.2.铵毒害可能的机制
• 2.GDP—甘露糖焦磷酸化酶
• 2.1.维生素C
• 2.1.1.维生素C在植物体内的生理功能
• 2.1.2.维生素C的合成途径
• 2.2.蛋白质糖基化
• 2.2.1.蛋白质糖基化的功能
• 2.2.2.N—聚糖的分类
• 2.2.3.GDP-甘露糖和GDP—海藻糖植物体内的生物合成过程
• 3.未折叠蛋白反应（UPR）
• 3.1.UPR的信号传导途径
• 3.2.UPR的细胞生理学功能
• 3.2.1.内质网相关蛋白降解（ERAD）
• 3.2.2.UPR诱导后能导致细胞周期停止
• 3.2.3.UPR能调控细胞程序性死亡
• 3.3.UPR在疾病中的作用
• 3.4.UPR过程中BiP和PDI的作用
• 3.4.1.BiP
• 3.4.2.PDI
• 第二章 突变体的筛选和表型分析
• 1.材料与方法
• 1.1.材料
• 1.2.方法
• 1.2.1.拟南芥种子表面灭菌
• 1.2.2.拟南芥的培养条件
• 1.2.3.突变体的筛选
• 1.2.4.根系参数的测量
• 1.2.5.铵离子浓度梯度实验
• 1.2.6.各种特殊培养基的配置
• 1.2.7.根尖淀粉粒染色方法
• 1.2.8.拟南芥杂交方法
• 1.2.9.GUS染色观察的方法
• 1.2.10.激光共聚焦（Confocal）扫描
• 1.2.11.铵含量的测定
• 2.结果
• 2.1.突变体筛选
• 4⁺抑制的'>2.2.突变体主根长是受NH₄⁺抑制的
• 2.3.hsn1根系表型的铵离子特异性
• 2.4.突变体根系构型的特点
• 2.5.hsn1突变体在1/2MS培养基条件下主根发育不完整
• 2.6.hsn1突变体铵离子吸收,代谢
• 3.讨论
• 3.1.突变体hsn1的突变症状与铵离子有关
• 3.2.突变体hsn1并未丧失吸收铵离子的能力
• 第三章 突变体hsn1的基因定位与克隆分析
• 1.材料与方法
• 1.1.材料
• 1.2.方法
• 2群体的构建及遗传分析'>1.2.1.F₂群体的构建及遗传分析
• 2群体DNA提取'>1.2.2.F₂群体DNA提取
• 1.2.3.图位克隆的方法
• 1.2.4.基因定位
• 1.2.5.基因克隆与测序分析
• 1.2.6.蛋白质同源性分析
• 1.2.7.RNA提取及反转录
• 1.2.8.目的基因转入拟南芥植株
• 1.2.9.原核蛋白表达分析
• 1.2.10.SDS-PAGE电泳:
• 1.2.11.Western blot
• 1.2.12.GMP酶活测定
• 2.结果
• 2.1.突变体的遗传分析
• 2.2.基因定位
• 2.3.候选基因的分析
• 2.4.野生型和突变体体内的GMP酶活测定:
• 2.5.GMP蛋白的同源与进化分析
• 3.讨论
• 第四章 维生素C含量分析与植物体内糖基化水平测定
• 1.材料与方法
• 1.1.材料
• 1.2.方法
• 1.2.1.拟南芥生长条件
• 1.2.2.维生素C（AsA）含量的测定
• 1.2.3.植物体内糖基化水平的测定
• 2.结果
• 2.1.维生素C（AsA）含量测定
• 2.2.植物体内糖基化水平的测定
• 3.讨论
• 第五章 拟南芥野生型和突变体hsn1地下部未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）和细胞死亡的检测
• 1.材料与方法
• 1.1.材料
• 1.2.方法
• 1.2.1.拟南芥生长条件和杂交方法
• 1.2.2.未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）的检测
• 1.2.3.植物细胞死亡的检测
• 2.结果与分析
• 2.1.未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）的检测
• 2.2.植物细胞死亡的检测
• 3.讨论
• 第六章 结论与展望
• 1.结论
• 2.展望
• 参考文献
• 攻读博士学位期间完成的科研论文