c-Abl激酶在β2整合素介导的信号转导途径中的作用研究

论文摘要

白细胞沿着血管内皮滚动、稳定粘附和跨内皮迁移,最终到达炎症部位是一个复杂的多步骤的过程,它的精确调控与机体的宿主防御和炎症反应密切相关。有多种粘附分子参与这一事件,其中β2整合素主要介导白细胞稳定粘附于血管内皮上和跨内皮的迁移。β2整合素是一类仅表达于白细胞表面的粘附分子家族,它包括四个成员,由一个共同的β亚基分别与四种α亚基形成非共价结合的异源二聚体。在静息的白细胞中,β2整合素以一种低亲和力和非粘附的状态存在。在炎症部位产生的细胞因子和趋化因子的刺激下,β2整合素能够迅速活化与其配体结合,这个过程为整合素的“inside-out”信号。活化的整合素能产生“outside-in”信号来调节细胞的骨架变化以及信号转导。β2整合素的信号对于中性粒细胞的稳定粘附和伸展非常关键,大量证据表明中性粒细胞的呼吸爆发、脱颗粒、蛋白的酪氨酸磷酸化等生理事件都依赖于β2整合素介导的细胞粘附。但是,对于中性粒细胞中β2整合素是如何调控细胞粘附的机制还不十分清楚。在中性粒细胞中,粘附引起的β2整合素的交联能够活化多种非受体酪氨酸激酶,这些激酶与细胞的骨架重排、生长、存活、运动密切相关。c-Abl激酶是一种非受体酪氨酸激酶,它参与多种受体引起的信号转导,并且参与了F-肌动蛋白依赖的细胞骨架变化。我们推测,c-Abl激酶可能参与了β2整合素介导的中性粒细胞粘附。本文主要探讨了c-Abl激酶在中性粒细胞的β2整合素信号转导中的功能和作用机制。我们的研究发现,在中性粒细胞中,β2整合素的交联能够增强c-Abl激酶的活性。细胞因子TNF-α能够引起细胞表面整合素表达的增加和活性的增强,但是c-Abl激酶抑制剂STI571并不影响这一变化,表明c-Abl激酶不参与TNF-α引起的整合素inside-out活化。而c-Abl激酶的抑制能显著降低细胞的稳定粘附和伸展,当干涉胞内的c-Abl激酶表达后也有相似的作用,因此c-Abl激酶主要参与了β2整合素的outside-in信号通路。在静息的中性粒细胞中,c-Abl激酶均匀的分布在细胞质内,而β2整合素介导细胞粘附之后,c-Abl激酶就募集到β2整合素富集的部位。通过蛋白质免疫沉淀和GST pull-down等实验,我们发现在β2整合素交联的中性粒细胞中,β2整合素与c-Abl激酶存在于同一个蛋白质复合体中,但二者的结合不是直接的。talin是一类骨架蛋白,它的头部与中性粒细胞中的β2整合素的胞浆尾部直接并持续地结合。活化的c-Abl激酶通过其SH3结构域与talin的头部结合,进而募集到β2整合素的胞浆尾部。Vav是一类鸟苷酸交换因子,它参与了β2整合素对中性粒细胞粘附的调控。我们的实验发现,在中性粒细胞中c-Abl激酶与Vav持续结合,并且在β2整合素产生的信号通路中c-Abl激酶能够调节Vav的活性。二者的作用方式是通过c-Abl激酶的SH3结构域与Vav的SH2结构域的结合。通过点突变实验,我们发现c-Abl激酶SH3结构域中的134位酪氨酸对于二者的结合很关键。我们的结果证明了,在β2整合素介导的中性粒细胞粘附过程中,c-Abl激酶能够被β2整合素活化。talin作为持续与β2整合素胞浆尾部结合的骨架蛋白,对于c-Abl激酶募集到β2整合素非常关键。活化的c-Abl激酶能够通过调节Vav的活性进而参与了对中性粒细胞的稳定粘附和伸展的调控。本论文揭示了c-Abl激酶在天然免疫过程中的新作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写词
• 前言
• 一、整合素概述
• （一） 整合素家族的组成和结构
• （二） 白细胞中表达的整合素
• （三） β2 整合素的配体
• （四） β2 整合素的生理功能
• 1. β2 整合素与白细胞骨架重排
• 2. β2 整合素与白细胞迁移
• 3. β2 整合素与白细胞的炎症效应
• 4. β2 整合素介导的信号事件
• （1） β2 整合素inside-out 信号
• （2） β2 整合素outside-in 信号
• 二、c-Abl 激酶概述
• （一） c-Abl 激酶的基本结构及细胞定位
• （二） c-Abl 激酶活性调节
• （三） c-Abl 激酶生理功能
• 1. c-Abl 激酶与细胞凋亡
• 2. c-Abl 激酶与细胞周期调控
• 3. c-Abl 激酶与基因转录调控
• 4. c-Abl 激酶与细胞信号转导
• 5. c-Abl 激酶的抑制剂
• 三、talin 概述
• （一） talin 的结构及分布
• （二） talin 与整合素活化
• 四、Vav 概述
• （一） Vav 的结构及分布
• （二） Vav 的功能
• 五、本论文的研究目的和意义
• 材料与方法
• 一、实验材料
• （一） 菌株、细胞、质粒和抗体
• （二） 试剂和酶类
• （三） c-Abl 激酶干涉质粒的合成
• （四） 主要仪器
• （五） 主要溶液和培养基
• 二、实验方法
• （一） 目的基因片段的扩增
• （二） 表达质粒的构建和测序
• （三） 蛋白质的表达
• （四） 中性粒细胞的提取
• （五） HL-60 细胞培养及分化
• （六） 免疫沉淀及激酶反应实验
• （七） Far Western 实验
• （八） GST pull-down 实验
• （九） 体外蛋白质结合实验
• （十） 免疫荧光双标记实验
• （十一） 流式细胞分析实验
• （十二） 细胞静止粘附检测
• （十三） 细胞氧呼吸爆发实验
• （十四） 细胞转染与c-Abl 激酶的干涉
• （十五） 数据分析
• 实验结果与分析
• 一、中性粒细胞的粘附能够活化c-Abl 酪氨酸激酶
• 二、c-Abl 激酶参与了β2 整合素介导的中性粒细胞的稳定粘附和伸展
• （一） c-Abl 激酶的抑制影响了β2 整合素介导的中性粒细胞的稳定粘附
• （二） c-Abl 激酶的干涉影响了β2 整合素介导的中性粒细胞的稳定粘附
• （三） c-Abl 激酶参与β2 整合素介导的中性粒细胞的呼吸爆发
• 三、c-Abl 激酶不参与TNF-α引起的β2 整合素的活化
• 四、c-Abl 激酶募集到β2 整合素依赖于β2 整合素介导的细胞粘附
• （一） β2 整合素交联引起c-Abl 激酶募集至其胞浆尾部
• （二） c-Abl 激酶通过其 SH3 结构域与β2 整合素的胞浆尾部相互作用
• 五、c-Abl 激酶通过talin 头部结构域与β2 整合素的胞浆尾部结合
• 六、c-Abl 激酶通过调节Vav 的活性来调控细胞粘附
• 讨 论
• 一、c-Abl 激酶参与 β2 整合素的 outside-in 信号转导
• 二、c-Abl 激酶调控 β2 整合素介导的中性粒细胞粘附和活化
• 三、talin 参与 c-Abl 激酶和 β2 整合素的相互作用
• 四、c-Abl 激酶调控 Vav 的活性
• 结论和主要创新点
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间公开发表论文及著作情况