唐静黄毅兰
（凉山彝族自治州第一人民医院药剂科615000）
【摘要】目的：改进HPLC法测定得力生注射液中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基血药浓度的方法。方法：以炔诺酮为内标，采用乙酸乙酯提取的方法处理血浆。色谱柱：phenomenexC-18柱（250×4.60mm，5μm）；流动相：乙腈:水（55:45）；流速：0.8ml/min；柱温：40℃；进样量：20μl；检测波长：296nm。结果：酯蟾毒配基在48.25~9650μg·L-1范围线性良好(r=0.9996)；华蟾酥毒基在51~1530μg·L-1(r=0.9998)。方法的提取回收率＞90％，日内和日间RSD＜10％。样品3次冻融及提取后在24h内稳定性良好。结论：本方法操作简便、灵敏度和准确度高、重现性好，适用于得力生注射液中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的体内药物浓度测定和药动学研究。
【关键词】得力生注射液，HPLC，华蟾酥毒基，酯蟾毒配基，血浆，药物浓度
【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】1671-8725（2014）12-0013-02
ImprovementofHPLCMethodintheDeterminationofResibufogeninandCinobufagininDelishenginjectininHumanPlasmaTANGJing,HUANGYilan（JINRong,YEYunDept.ofPharmacy,TheAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China）abstract:Objective：ToimprovetheHPLCmethodintheDeterminationofResibufogeninandCinobufagininDelishenginjectininHumanPlasma.Methods：Usingnorethisteroneasinternalstandard,theplasmawasextractedwithethylacetate.ThedeterminationwascarriedoutusinganphenomenexC-18column（250×4.60mm，5μm）withasolventsystem:acetonitrile-water(55:45).Theflowratewas0.8ml/min,columntemperaturewas40℃,samplesizewas20μl,detectiongwavelengthwasat296nm.Results：Thelinearrangeofresibufogeninwas48.25~9650μg·L-1(r=0.9996),TheCinobufaginwas48.25~9650μg·L-1(r=0.9998).Therecoveryofextractionwasmorethan90％.Boththeintra-dayRSDandinter-dayRSDwerelessthan10％.Thesampleshowedagoodstabilitywithin24hoursafterthreefreeze-thawcyclesandextractions.Conclusion：Themethodissimple,sensitive,accurateandreproducible,andsuitableforthedeterminationandpharmacokineticstudyoftelmisartaninhumanplasma.Keyword：Delishenginjection；HPLC；Resibufogenin；Cinobufagin；Plasma；Plasmadruglevel
得力生注射液是我国第一个获得中药二类新药证书的复方抗癌注射液，由人参、黄芪、蟾酥、斑蟊四味中药经现代科学技术提炼加工而成，配合放化疗具有协同增效作用，并能够预防化疗导致的骨髓抑制[1]。通过对其组方中蟾酥的有效成分华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的血药浓度测定，为临床选择药物用量提供参考，达到增加药物疗效，控制不良反应发生的作用。关于这两种成分的测定方法，现多采用标准曲线法，但因每次样品分析的色谱条件很难完全相同，容易出现较大误差。本文在重复比较文献并反复试验的基础上，选用炔诺酮作内标，准确度高、重复性好，可用于得力生注射液的体内药物浓度测定和药动学研究。
1材料
1.1仪器
YKH-Ⅲ型液体快速混合器（江西医疗器械厂），B600型低速自动平衡离心机（白洋离心机厂），HH-W21-Cr600电热恒温水浴箱（广东省汕头市医用设备厂），戴安DIONEXUltimate3000色谱仪，色谱柱：phenomenexC18(250mm×4.6mm,5μm),色谱数据处理软件：Chromeleon(c)DionexVersion6.8SP2,药物代谢动力学分析软件DAS2.1.1版。统计软件SPSS10.0版。
1.2试药
华蟾酥毒基对照品（中国药品生物制品检定所，批号110803-200504）,酯蟾毒配基对照品（中国药品生物制品检定所，批号110718-200507），炔诺酮对照品（中国药品生物制品检定所，批号100053-200204），得力生注射液（北京正邦制药有限公司，批号080207），甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氟化钠均为分析纯，水为三蒸水。
2方法
2.1色谱条件
色谱柱：phenomenexC18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈-水（55：45）；流速：0.8ml·min-1；柱温：40℃；进样量：20μl；紫外检测波长：296nm。
2.2对照品溶液的制备
精确称取经干燥的华蟾酥毒基10.24mg、酯蟾毒配基9.98mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成二者含量分别为1.024mg/ml和0.998mg/ml的储备液，于4℃冰箱保存备用。
2.3内标溶液的制备准确称取经干燥的炔诺酮对照品，加甲醇溶解配成浓度为40mg·L-1的溶液，作为内标工作液，于4℃冰箱保存。
2.4血浆样品的处理
精密加入血浆0.1ml，取内标液0.1ml，甲醇0.1ml，氟化钠饱和溶液0.2ml，置于10ml试管中，混匀后加入乙酸乙酯2ml，涡旋混匀10min，3000r·min-1离心10min。吸取上层有机相于尖底玻璃试管中，40℃水浴空气流吹干。残留物用30μl甲醇溶解，取上清夜20μl进样分析。
3分析方法的验证
3.1专属性考察
取空白血浆0.1ml，按“2.4”项下（不加内标）处理进样分析，详见图1A。取空白血浆0.1ml，按“2.4”项下处理进样分析，详见图1B。取空白血浆0.1ml，加入华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品溶液，按“2.4”项下处理进样分析，详见图1C。取空白血浆0.1ml，加入得力生注射液，按“2.4”项下处理进样分析，详见图1D。结果：空白血浆不干扰华蟾酥毒基、酯蟾毒配基及内标的分离。理论板数按华蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰计算均大于8000，分离度均大于1.5。
A.空白血浆；B.空白血浆+内标；C.空白血浆+华蟾酥毒基+酯蟾毒配基+内标；E.空白血浆+得力生注射液+内标Fig1HPLCA.blankplasma；B.blankplasmaplusinternalstandard；C.blankplasmapluscinobufagin、resibufogeninandinternalstandard；D.blankplasmaplusdelishenginjectionandinternalstandard
3.2内标物的评价
精密称取炔诺酮10.21mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，加甲醇稀释成浓度分别为10.21、20.42、30.63、40.84、51.05、61.26μg/ml溶液。精密量取酯蟾毒配基储备液适量，加甲醇稀释成浓度分别为9.65、4.83、0.97、0.48、0.24、0.12μg/ml的溶液。由低到高取两组中对应浓度的溶液各50μl混合，得到6份炔诺酮与酯蟾毒配基的混合溶液，混匀，6份溶液按“2.4”项下处理进样分析。平行操作两次，分别记录酯蟾毒配基和内标的峰面积。取两次峰面积均值，分别得到炔诺酮峰面积（A炔）以及酯蟾毒配基峰面积（A酯），按式R=（A酯×C炔）/（A炔×C酯）计算各样品中两成分的峰面积比值R，其中C炔、C酯分别为两成分对应的各浓度。经计算表明，6份混合液平均R值为1.5％，比值相对恒定，表明炔诺酮适合作为酯蟾毒配基的内标。
同法，测得不同浓度炔诺酮面积与华蟾酥毒基峰面积的R值为1.6％，表明炔诺酮也适合作为华蟾酥毒基的内标。
3.3标准曲线绘制及线性关系考察
取空白血浆分别精密加入一定量华蟾酥毒基和酯蟾毒配基贮备液，使血浆华蟾酥毒基浓度分别为51、51、102、255、510、1020、1530μg·L-1；血浆酯蟾毒配基浓度为48.25、96.5、241.25、482.5、965、4825、9650μg·L-1。按照“2.4”项下方法操作测定，以待测物与内标物的峰面积之比对相应的标准血浆质量浓度作图，进行线性回归，结果华蟾酥毒基在51~1530μg·L-1范围内线性关系良好（r=0.9996,n=7），最低定量限为：51μg·L-1；酯蟾毒配基在48.25~9650μg·L-1范围内线性关系良好（r=0.9998,n=7），最低定量限为：48.25μg·L-1。
3.4精密度与回收率试验
同“3.3”项下标准曲线工作液的配制方法配制含华蟾酥毒基0.102、0.51、1.53mg·L-1和酯蟾毒配基0.0965、0.4825、9.65mg·L-1的模拟血浆样品，照“3.2”项下方法操作，测得本法回收率及精密度，详见表2。
Tab1Recoveryandprecision(n=3)
3.5稳定性试验
取-20℃保存的低、中、高三种浓度（按“3.4”项下配制）的人血浆样品，在0、3、7、14d，分别测定紫杉醇、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基浓度。结果表明血浆样品在-20℃保存6天，浓度无明显变化。对比测定冻融并室温放置0、2、6、8h及反复冻融3次的样品，显示冻融和室温放置对测定结果无明显影响。3种浓度的质控样品与每批待测样品平行预处理后，测定浓度，结果均符合质量控制要求。
4讨论：
4.1本法采用紫外检测器检测华蟾酥毒基和酯蟾毒配基在296nm处的吸收峰。分别考察了乙腈:0.5%KH2PO4(50:50)、0.04%KH2PO4:正丙醇:甲醇（7:2:3）、乙腈:水（60:40）等多个流动相，经比较，流动相：乙腈:水（55:45），流速：0.8ml·min-1条件下，两成分峰型和分离度较好，保留时间较少，且无缓冲盐影响，仪器损伤较小，是比较理想的流动相。
4.2血浆样品处理时加入氟化钠饱和溶液是为了防止血中残余酶对药物的破坏，同时在离心后能够形成水层，分开了蛋白质沉淀和有机层，避免蛋白质沉淀微粒随有机层被吸取进入色谱仪，堵塞色谱柱。在进行萃取试剂的选择时，考察了乙醚、石油醚、丙酮、氯仿、正己烷等多种萃取溶剂，乙酸乙酯提取效率较高，且毒性较小，故选用其为萃取剂。在考查了得力生注射液的血浆样品处理结果及色谱图后发现增加萃取次数会增加杂质的浓度而对结果造成影响，因此最后决定进行1次萃取。
4.3在生物样品的分析中往往采用内标法来消除预处理过程及色谱过程中的系统误差。而目前对得力生注射液中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的测定多采用外标法（也称标准曲线法或直接比较法），容易出现较大误差。本方法用炔诺酮作为内标，以减少操作误差，定量准确，且简单易行，可行性好。所建方法灵敏度高，线性关系良好，线性范围大，日内及日间精密度误差小，相对偏差小。该方法的建立为紫杉醇和得力生注射液合用治疗肿瘤提供了简便的血药浓度检测方法，为临床合理用药和研究两药的药代动力学以及生物利用度提供科学的依据。
参考文献
[1]陈信义，雒琳.得力生注射液组方科学依据与临床应用前景分析[J].现代肿瘤医学，2006,14(3):378-380.