论文摘要
第一部分：实验性蛛网膜下腔出血后海马在不同时间点凋亡相关因子（Caspase3、Bax、Bcl-2）的基因表达目的：探讨蛛网膜下腔出血后海马在不同时间点凋亡相关因子（Caspase3、Bax、Bcl-2）的基因表达变化,找出变化明显的时间点,予以药物干预。材料和方法：1.实验材料成年雄性Wistar大鼠48只,年龄2个月,体重250-300g,由山东大学实验动物中心提供,实验动物单笼喂养,标准饲料喂养1周后再行枕大池二次注血。2.实验方法实验用大鼠随机分成6组,每组各8只动物。选择体重250-300g健康成年雄性Wistar大鼠,采用枕大池内新鲜自体动脉血二次注入法建立SAH鼠模型。将大鼠称重后用10%水合氯醛溶液400mg／kg腹腔注射麻醉后,仰卧位固定于鼠板上,沿右侧腹股沟切开皮肤皮下,钝性游离股动脉,抽取新鲜的动脉血0.5mL备用,结扎止血,逐层缝合。然后将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪,术区皮肤消毒,沿颈背部中线切开皮肤皮下,钝性分离肌层至显露寰枕膜,穿刺寰枕膜并抽出0.1mL脑脊液,5min内将自体动脉血0.3mL缓慢注入枕大池。头低位30°维持30min,使血液均匀地分布于基底池,首次注血48 h后同样方法第二次枕大池注血,制作大鼠SAH模型。用Real-Time PCR技术检测凋亡分子caspase-3和bax以及抗凋亡分子bcl-2在不同时间点的变化情况。结果：1.大鼠SAH后有神经功能障碍,运动较前迟缓,触须反应减弱,进食量下降。2.二次注血后,凋亡分子caspase-3表达量实验组较空白对照组均有所上升,以1d、2d、3d上升明显,与空白对照组相比有统计学差异（p<0.01）；bax的基因表达水平也均有所上升且在SAH后2d变化最明显与空白对照组相比有统计学差异（p<0.01）；抗凋亡分子bcl-2的表达量实验组与空白对照组相比差异无统计学意义。结论：1.本实验通过枕大池二次注血法制作的大鼠SAH模型,行为学及饮食状况较空白对照组有明显的变化,凋亡分子的表达也有统计学差异并且组内数值的差异较小,实验结果提示此模型是一种稳定理想的SAH模型。2.凋亡分子caspase-3、bax在二次注血后2d与空白对照组相比有统计学差异。第二部分：抗TNF-α单克隆抗体对实验性蛛网膜下腔出血大鼠不同脑区细胞Caspase3、Bax、Bcl-2的影响目的：研究TNF-α特异性抑制剂抗TNF-α单克隆抗体对SAH后不同脑区神经细胞Caspase3、Bax、Bcl-2影响,以探讨蛛网膜下腔出血后细胞凋亡部分信号转导通路机制。材料和方法：1.实验材料成年雄性Wistar大鼠48只,由山东大学实验动物中心提供,实验动物单笼喂养,标准饲料喂养1周后再行枕大池注血,体重250-300g。2.实验方法动物随机分成3组：①空白对照组：不做任何处理；②PBS组：SAH+PBS溶剂；③TNF组：SAH+anti-TNF-α,每组16只,如有死亡,及时予以补充。SAH前30min侧脑室注射抗TNF-α单克隆抗体：大鼠称重后,用10%水合氯醛溶液4ml／kg腹腔注射麻醉后,额顶部去毛,置于立体定位仪上,固定头部,头皮酒精消毒,矢状切开头皮,暴露顶骨,顶骨平行于水平面,用牙科磨钻在前囟点后0.8mm,中线旁1.5mm处钻一直径0.77mm骨窗。在同一骨窗里,用与10ul微量注射器穿刺右侧脑室,坐标：AP,-0.8mm; lateral,-1.5mm; vertical,-4.0mm,注射速度为0.5ul／min,留针10min, PBS组注射anti-TNF-α的溶剂PBS 10ul,TNF组注射TNF-α抗体anti-TNF-αlOul,拔针后,骨蜡封闭骨孔。SAH模型的具体制备方法详见第一部分。用Real-Time PCR技术检测凋亡分子caspase-3和bax以及抗凋亡分子bcl-2在SAH后2d各组基因表达的变化情况,用原位杂交技术验证caspase-3 mRNA表达的变化；用Western blot技术检测caspase-3、bax、bcl-2在SAH后2d各组蛋白表达的变化情况。3.统计学处理所有实验数据采用均数±SEM,组间比较采方差分析,p<0.05表示有统计学差异,全部统计学分析采用SPSS13.0统计软件。结果：1.海马细胞的caspase-3、bax的基因及蛋白的表达PBS组、TNF组较空白对照组均有明显增加,PBS组与其它两组相比有统计学差异（p<0.05）；bcl-2的基因及蛋白的表达三组无明显差异。2.下丘脑细胞的bax的基因及蛋白的表达PBS组、TNF组较空白对照组均有增加且PBS组与空白对照组相比有统计学差异（p<0.05）,caspase-3、bcl-2的基因及蛋白的表达三组无明显差异。3.前额叶细胞的bax的基因及蛋白的表达PBS组与其它两组相比有统计学差异（p<0.05）,TNF组较空白对照组有所升高但无统计学差异,bcl-2三组的基因表达无差异,蛋白量PBS组、TNF组有明显增高,与空白对照组有统计学差异（p<0.05）,而caspase-3的基因及蛋白的表达三组均无明显差异。结论：抗TNF-α单克隆抗体在海马能明显抑制caspase-3表达,亦能抑制海马、下丘脑及前额叶bax的表达,说明TNF-α有可能激活bax的表达,进而促进凋亡的发生。
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