论文摘要
研究目的:本研究利用慢性非缓解型小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）模型和小胶质细胞体外培养模型,探讨小胶质细胞活化在慢性EAE轴索损伤中的作用机制,以及米诺环素的炎症抑制和神经保护作用,研究方法:（一）动物实验部分:利用MOG 35-55抗原多肽免疫C57BL/6小鼠建立EAE动物模型,分为对照组、EAE组和米诺环素治疗组,分别在动物发病前期（～免疫后9天）、发病初期（免疫后12～17天）、发病高峰期（免疫后21～25天）和慢性维持期（免疫后32天～）处死动物,取脑组织和脊髓。用组织学方法进行HE染色、LFB染色和Bielschowsky染色;免疫组化方法检测Iba1、APP和NF蛋白;RT-PCR方法检测IFN-γ和IL-10 mRNA含量;Western Blot方法检测p-p38 MAPK蛋白含量。（二）细胞实验部分:建立小胶质细胞体外培养模型,分为对照组、LPS活化组和米诺环素干预组,分别在3、6、12、24和48小时取各组细胞培养液。利用ELISA方法检测TNF-α和IL-1β蛋白含量,Griess Reagent方法检测NO含量。研究结果:（一）动物实验部分:1、实验小鼠的临床神经功能变化:对照组小鼠未发病;EAE组和治疗组小鼠在免疫后12～17天相继发病,临床表现无差异,治疗组开始用药;21～25天到发病高峰期,EAE组较治疗组小鼠临床症状明显加重;32天后进入维持期,两组症状持续,治疗组症状较轻,疾病呈典型的慢性非缓解性特点。2、实验小鼠脑组织和脊髓的神经病理变化:EAE组小鼠在发病高峰期HE染色见多个部位血管炎,血管周围大量炎性细胞浸润,成“袖套”样改变,小血管明显扩张;LFB染色见白质疏松,髓鞘不连续、断裂、空泡样改变,部分区域髓鞘呈现白色片状脱失;APP免疫组化染色可见到轴索急性损伤后的异常染色;Iba-1免疫组化染色见到激活的小胶质细胞变大肿胀,出现突起,并数量增多;在EAE慢性维持期,Bielschowsky染色可见轴索肿胀粗细不等、断裂和变形,以及轴索卵形体的形成;NF免疫组化染色可见轴索结构变细、断裂、变形、甚至缺失。治疗组小鼠在相应发病期的病理上均有明显减轻。3、实验小鼠在各时间点脑组织和脊髓内炎性因子mRNA表达的变化:①IFN-γmRNA表达的变化:对照组有少量IFN-γmRNA的表达,在各时期表达也无变化。EAE组发病前期表达与对照组无差异,在发病初期表达显著升高,并维持至发病高峰期,升高幅度达8～6倍,到慢性维持期以后,表达明显减弱,但仍高于对照组。治疗组小鼠表达在发病初期与EAE组无差异,但在高峰期表达明显减少,维持期的表达仍较EAE组减少,几乎回到对照组水平。②IL-10 mRNA表达的变化:对照组有少量IL-10 mRNA的表达,在各时期表达也无变化。EAE组发病前期表达与对照组无差异,在发病初期表达开始升高,并维持至发病高峰期,到慢性维持期以后,表达继续增高达6倍左右。治疗组小鼠表达在发病初期与EAE组无差异,但在高峰期表达明显增高,到慢性维持期表达仍较EAE组明显增高。4、实验小鼠在发病高峰期脑组织和脊髓内p-p38 MAPK蛋白表达的变化:对照组有少量p-p38 MAPK蛋白的表达;EAE组的表达明显升高,达3倍左右;治疗组的表达显著降低,但仍较对照组组为高。（二）细胞实验部分:1、小胶质细胞体外培养生长情况:培养的小胶质细胞为圆形、折光性强的小细胞,经FITC-IB4标记鉴定,纯度达95%以上。用LPS激活活化后,形态上细胞胞体相对增大,呈巨噬细胞样,伴有多个细长的突起。2、各时间点小胶质细胞产生细胞毒性因子表达的变化:对照组正常细胞生长环境中也有少量存在,其产生也具有时间依赖性。活化组细胞经LPS激活后产生的TNF-α水平升高最早,在3小时已有显著增高;IL-1β在6小时才出现显著性升高;而NO最晚,直到12小时才出现显著性升高。干预组中的TNF-α在3～48小时各时间点均可见到其含量较活化组显著下降;IL-1β在6～48小时时间点可见含量到较活化组显著下降;而NO在12～48小时时间点含量较活化组显著下降。研究结论:（一）小胶质细胞活化可能是导致慢性EAE中轴索损伤的重要机制。（二）米诺环素抑制小胶质细胞活化可能参与了轴索损伤的保护。（三）p38 MAPK途径可能参与了米诺环素对小胶质细胞活化的抑制。
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