海南产芋螺蛋白质二硫键异构酶的研究与芋螺毒素Ma6A、Ma6B的原核表达

论文摘要

芋螺（Conus）属腹足纲芋螺科的肉食性海洋软体动物,全球约500多种。芋螺毒素（Conopeptides, Conotoxins, CTXs）是一类由芋螺分泌产生的具有生物活性的神经毒素肽。研究者普遍认为每种芋螺可能含有100-200种特异的芋螺毒素,这意味着全球约有50000种芋螺毒素。芋螺毒素通常是由不多于40个的氨基酸残基组成,富含二硫键,化学结构新颖,生物活性强,作用靶位的选择性高,目前发现的芋螺毒素超家族主要有O-, A-, T-, M-, P-, I-和S-超家族等。它们已在神经科学研究领域和新药研制方面受到了前所未有的广泛关注,因此对芋螺毒素进行深入研究意义重大。蛋白质二硫键异构酶是内质网新生肽链折叠中一个重要的折叠酶。在热带药用海洋生物芋螺的毒液中,富含PDI酶,该酶对于毒液中芋螺毒素神经肽的体内氧化折叠至关重要。本研究主要得到以下实验结果：（1）主要采用凝胶过滤层析和制备型Rotofor液相等电聚焦电泳等多种方法,从海南产桶形芋螺（Conus betulinus）毒管中分离纯化天然的PDI酶蛋白,经电泳和MALDI-TOF-MS质谱鉴定分析确证获得了高纯度的桶形芋螺PDI酶,建立了天然芋螺PDI酶分离纯化的技术方法。以芋螺毒素线性肽K412为底物进行了PDI酶活性鉴定,结果表明该分离纯化的PDI酶能够促进K412的氧化折叠。（2）利用PCR方法克隆得到三种海南产桶形、疣缟和织锦芋螺的PDI基因及序列,然后进一步亚克隆获得酶切位点用于表达载体的构建。关于PDI基因,我们成功构建了4个表达载体,分别为：pET22b（+）-PDI42、pET22b（+）-PDI49, pET28b（+）-PDI12 and pET28b（+）-PDI19c（3）合成了O-超家族芋螺毒素Ma6A、Ma6B的成熟肽基因,每种毒素的成熟肽基因都分为有终止密码子和没有两种,可以相应的表达出不带His-Tag和带His-Tag的芋螺毒素肽。Ⅰ（?）A2、PB2、PA3和PB3是4种构建成功的Ma6A Ma6B的表达载体。（4）构建的部分表达载体pET22b（+）-PDI42、PA2、PA3和PB3进行了原核诱导表达的研究,并在大肠杆菌BLR21（DE3）菌株中成功的表达了PDI酶蛋白（PDI42）、不带His-Tag标签的芋螺毒素Ma6A（PA2）、带His-Tag标签的芋螺毒素Ma6A（PA3）和带His-Tag标签的芋螺毒素Ma6B（PB3）.由于芋螺毒素的氧化折叠非常复杂,且氧化折叠后具有正确二硫键连接方式的芋螺毒素才具有各种药理活性,因此,本研究结果为后续PDI酶在种类繁多的芋螺毒素氧化折叠中的应用及其作用机制研究提供了重要的物质基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 芋螺生物学
• 2 芋螺毒素研究概述
• 2.1 芋螺毒素的分类与命名
• 2.2 芋螺毒素的分子生物学
• 2.3 芋螺毒素的翻译后修饰
• 2.4 芋螺毒素的药理学
• 2.5 芋螺毒素的获取途径
• 2.6 芋螺毒素氧化折叠与蛋白质二硫键异构酶
• 2.7 芋螺毒素的研究前景
• 3 本研究的目的意义及技术路线
• 3.1 本研究的目的和意义
• 3.2 技术路线
• 第二部分 海南产桶形芋螺蛋白质二硫键异构酶的分离纯化及鉴定
• 1 实验材料和仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂和缓冲液
• 1.3 分子生物学和纯化试剂
• 1.4 仪器和设备
• 2 实验方法
• 2.1 桶形芋螺毒液蛋白的提取
• 2.2 毒液蛋白的凝胶过滤层析
• 2.3 毒液蛋白的等电聚焦电泳
• 2.4 MALDI-TOF质谱鉴定
• 2.5 PDI酶活性鉴定
• 3. 结果与分析
• 3.1 桶形芋螺毒液总蛋白的提取
• 3.2 毒液蛋白的凝胶过滤层析
• 3.3 毒液蛋白的等电聚焦电泳
• 3.4 纯化桶形芋螺PDI酶的MALDI-TOF质谱鉴定
• 3.5 PDI酶活性鉴定
• 第三部分 PDI基因的克隆、表达载体构建与诱导表达
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 设计的PDI引物序列
• 1.3 工具酶及试剂
• 1.4 培养基与抗生素
• 1.5 试剂溶液和缓冲液
• 1.6 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 PDI基因的PCR扩增
• 2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.3 PDI目的基因片段的琼脂糖电泳回收
• 2.4 连接T载体反应
• 2.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备
• 2.6 大肠杆菌DH5α感受态菌转化效率检测
• 2.7 转化大肠杆菌及蓝白斑筛选
• 2.8 PCR检测T载-PDI基因重组子
• 2.9 提取质粒载体DNA（试剂盒法）
• 2.10 T载-PDI基因重组子测序
• 2.11 PDI基因亚克隆
• 2.12 PDI亚克隆重组子双酶切
• 2.13 表达载体质粒准备
• 2.14 连接转化
• 2.15 表达载体重组子的鉴定和筛选
• 2.16 表达载体重组子测序
• 2.17 重组子的转化和诱导表达（小量诱导表达）
• 2.18 蛋白质SDS-PAGE电泳
• 3 结果与分析
• 3.1 PDI基因克隆
• 3.2 PDI基因测序结果
• 3.3 PDI基因表达载体构建
• 3.4 PDI的诱导表达
• 第四部分 芋螺毒素MA6A和MA6B基因原核表达研究
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 设计成熟肽序列
• 1.3 工具酶及试剂
• 1.4 抗生素与培养基
• 1.5 缓冲液以及试剂液
• 1.6 仪器和设备
• 2 方法
• 2.1 Ma6A和Ma6B成熟肽单链的退火
• 2.2 pET22（b）+质粒酶切
• 2.3 连接转化
• 2.4 重组子的鉴定筛选
• 2.5 表达载体重组子测序
• 2.6 重组子的转化和诱导表达（小量诱导表达）
• 2.7 重组子的大量诱导表达
• 2.8 蛋白质SDS-PAGE电泳
• 2.9 蛋白质的亲和层析
• 3. 结果与分析
• 3.1 Ma6A和Ma6B成熟肽单链的退火
• 3.2 pET22（b）+质粒酶切
• 3.3 连接转化与菌液PCR鉴定
• 3.4 Ma6A和Ma6B的诱导表达
• 3.5 蛋白质的亲和层析
• 第五部分 讨论
• 第六部分 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者在读期间科研成果简介