家蚕核酸切除修复相关基因的克隆与功能分析

论文摘要

DNA是生物体内携带遗传信息的重要物质,由于自身结构的特殊性和外界环境的影响,DNA在复制过程中必然会受到各种损伤从而需要细胞进行修复。研究DNA损伤修复机制,可以使人们更准确地理解生物稳定其遗传信息的机理,更深入地了解基因突变与进化的分子过程。核酸切除修复（NER）途径是生物体内DNA损伤的主要修复方式,Rad23基因、Rad4基因等是该NER途径中具有重要功能的修复因子。已有的研究发现Rad23基因在单细胞的低等生物（酵母）和高等哺乳生物细胞（人类）中对造成DNA损伤的紫外射线等外界因素的响应机制存在差异,家蚕在进化关系上是属于酵母和人类之间的高等生物,并且是鳞翅目的模式昆虫。家蚕遗传性状的长期研究积累和功能基因组学的研究结果为全面、准确的了解家蚕生物性状分子调控机制提供了基础。因此,研究家蚕BmRad23基因和BmRad4基因的结构与功能,探讨家蚕修复DNA损伤机理,对于阐明生物细胞NER等DNA损伤修复机理具有重要意义,对于辐射肓种、提高肿瘤放疗效果等也具有重要参考价值。本论文在分析大量家蚕组织EST数据、基因组数据等的基础上,利用RT-PCR和RACE技术克隆了家蚕BmRad23基因和BmRad4基因,并对BmRad23基因的功能做了研究,具体研究结果如下：（1）利用电子与实验克隆相结合的方法,成功克隆了家蚕BmRad23基因,BmRad23 cDNA全长序列由1304 bp碱基组成,5’UTR和3’UTR分别为165bp、164bp, ORF长975bp,编码324个氨基酸。利用生物信息学的方法解析氨基酸序列的结构与功能域信息,BmRad23氨基酸序列分别包含有UbL（1-74位氨基酸）、两个UBA（135-172、282-319位氨基酸）功能域以及一个XPC结合位点。（2）构建了pET28a/BmRad23表达载体,在大肠杆菌中成功表达了BmRad23蛋白,纯化后的BmRad23蛋白作为抗原免疫新西兰兔,得到了特异性良好的多克隆抗体。（3）通过Northern blot、Western blot技术对BmRad23基因组织表达特异性和时期表达特异性进行了分析,发现BmRad23基因在家蚕精、卵巢中表达量明显偏高,推测BmRad23在5龄后期幼虫精巢、卵巢中表达量的增加是由于生殖细胞减数分裂的原因造成的。此结果表明：BmRad23具有与其它物种Rad23在细胞减数分裂中发挥重要功能相似特性,在细胞减数分裂等组织细胞重要发肓时期发挥关键作用。此外,BmRad23在家蚕变态时期（预蛹期与蛹期）的丝腺中表达量增高,因BmRad23具有UBL/UBA功能域,在变态期组织蛋白质的降解过程中具有起到运送目的蛋白和控制蛋白降解过程的作用。因此BmRad23在家蚕变态期的组织细胞凋亡、蛋白质降解过程中也具有重要功能,是调节和控制蛋白降解的一个关键因素。BmRad23在家蚕细胞受到具有遗传毒性的因素（如紫外辐射、NA-AAF）伤害时表达量会增高,而没有遗传毒性的热激反应并不会对BmRad23的表达量产生影响。此结果显示家蚕细胞也具有修复DNA损伤机制的NER途径,并且BmRad23基因功能具有一定的专一性。家蚕虽然是多细胞的高等生物,但其细胞在紫外线照射下BmRad23基因的应答反应是与单细胞的酵母相似,而与高等哺乳生物的人类细胞对紫外线照射下Rad23基因的应答反应有差异,推测家蚕细胞对于修复DNA损伤的机制更接近于单细胞的酵母。（5）利用电子克隆和RACE方法首次克隆了家蚕Rad4基因,cDNA全长为3397bp,命名为BmRad4。BmRad4cDNA的5’UTR为52bp,3’UTR为459bp,ORF长2886bp,编码961个氨基酸,分子量为110kDa,等电点为9.03。生物信息学分析表明BmRad4氨基酸序列中含有典型的Rad4功能结构域和Rad4β发卡结构。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1 DNA损伤修复背景介绍
• 1.1 造成DNA损伤的因素
• 1.2 DNA损伤修复机制类型简介
• 2 核酸切除修复（NER）途径
• 2.1 NER修复途径的组成部分
• 2.2 NER修复途径的修复过程
• 2.3 NER修复途径的保守性
• 3 泛素/蛋白酶体（UPP）途径
• 3.1 底物蛋白泛素化
• 3.2 泛素化蛋白降解
• 4 Rad23基因的研究进展
• 4.1 Rad23蛋白的结构与功能域
• 4.2 Rad23在UPP途径中的功能
• 4.3 Rad23在NER途径中的功能
• 研究目的和方案
• 第二章 家蚕Rad23基因的克隆及生物信息学分析
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 供试动物材料、工具酶和化学试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常用试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 家蚕总RNA的提取
• 2.2.2 核酸质量及浓度测定
• 2.2.3 克隆家蚕Rad23基因
• 2.2.4 家蚕Rad23基因的生物信息学分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Rad23基因克隆结果
• 2.3.2 家蚕Rad23基因序列分析
• 2.4 讨论
• 第三章 BmRad23基因的原核表达及抗体制备
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 质粒和菌株
• 3.1.2 试剂及酶
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 试剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 BmRad23基因表达载体的构建
• 3.2.2 BmRad23在大肠杆菌中的表达
• 3.2.3 BmRad23融合表达产物的纯化
• 3.2.4 多克隆抗体的制备及纯化
• 3.2.5 多克隆抗体特异性鉴定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 表达载体构建及验证结果
• 3.3.2 BmRad23表达与纯化
• 3.3.3 抗体特异性鉴定结果
• 3.4 讨论
• 第四章 BmRad23基因组织、时期差异性表达
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 供试动物材料、工具酶和化学试剂
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 常用试剂配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 Northern blot分析家蚕不同组织以及丝腺不同时期的BmRad23表达
• 4.2.2 Western blot鉴定家蚕内源BmRad23蛋白及表达的时期差异性
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 Northern blot分析BmRad23在家蚕中的组织与时期特异性表达
• 4.3.2 Western blot分析BmRad23在家蚕中的组织与时期特异性表达
• 4.4 讨论
• 第五章 外界刺激诱导BmRad23基因差异性表达
• 5.1 材料与试剂
• 5.1.1 细胞、工具酶和化学试剂
• 5.1.2 主要仪器设备
• 5.1.3 试剂配制
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 紫外辐射处理细胞
• 5.2.2 NA-AAF处理细胞
• 5.2.3 热激处理细胞
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 紫外辐射对BmRad23基因表达的影响
• 5.3.2 NA-AAF、热激对BmRad23基因表达的影响
• 5.3.3 热激因素对BmRad23基因表达的影响
• 5.4 讨论
• 第六章 家蚕Rad4基因的克隆及生物信息学分析
• 6.1 材料与试剂
• 6.1.1 供试动物材料、工具酶和化学试剂
• 6.1.2 主要仪器设备
• 6.1.3 常用试剂配制
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 数据库检索与分析
• 6.2.2 实验克隆家蚕Rad4基因
• 6.2.3 家蚕Rad4基因的生物信息学分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 Rad4基因克隆结果
• 6.3.2 Rad4基因生物信息学分析
• 6.4 讨论
• 第七章 总结与展望
• 7.1 主要总结
• 7.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录