鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立

论文摘要

鸭源鸡杆菌（Gallibacterium anatis）是巴氏杆菌科,鸡杆菌属的代表种。该菌可参与感染产蛋母鸡,引发一系列慢性、进行性生殖道疾病,如输卵管炎、输卵管囊肿,是引起产蛋量下降的一个重要病原体。近年来,国内外对于鸭源鸡杆菌的研究主要是针对其致病性和发病机理,对于鸭源鸡杆菌的血清学研究较少。本研究利用实验室保存的鸭源鸡杆菌菌株YU-PDS-RZ-1-SLG制备超声波裂解抗原,建立了可以检测鸭源鸡杆菌所有血清型抗体的间接ELISA方法:包被抗原浓度为10μg·mL-1,包被条件为37℃2h,然后4℃过夜,封闭液为1%明胶,封闭条件为37℃1h,阴、阳性血清最佳稀释度为1:100,酶标二抗工作浓度为1:1000,底物显色时间为15min。经交叉性试验、阻断试验和重复性试验证实建立的ELISA方法重复性好,特异性强。板内变异系数为2.01%5.75%,板间变异系数为2.43%6.20%。间接ELISA方法的灵敏度是微量凝集试验的25100倍。利用所建立的ELISA方法检测了人工感染鸭源鸡杆菌的3日龄SPF鸡在感染后不同阶段感染组,同居组和空白对照组的血清抗体1:10稀释后的OD450,根据感染后不同阶段所测OD450绘制抗体消长曲线,大致了解了其抗体消长的规律:抗体水平在感染后2个月左右达到高峰,但维持时间较短,随后逐渐下降。建立的间接ELISA方法可以用于临床病例的血清学快速检测,为进行鸭源鸡杆菌的血清流行病学调查、免疫程序的制定及免疫效果的评价提供了手段。利用实验室保存的鸭源鸡杆菌菌株YU-PDS-RZ-1-SLG提取鸭源鸡杆菌脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）作为检测抗原,确定ELISA方法的最佳工作条件:包被抗原的浓度为2.77μg·mL-1,包被条件为37℃1.5h,4℃过夜,封闭液为1%明胶,封闭条件为37℃1h,阴、阳性血清最佳稀释度为1:1600,酶标二抗工作浓度为1:3000,底物显色时间为15min。将鸭源鸡杆菌裂解抗原及提取的脂多糖用PBS稀释到适当浓度,加入弗氏完全/不完全佐剂制成乳化抗原免疫Balb/c小鼠。按常规方法进行融合,用间接ELISA方法进行筛选,采用有限稀释法,经过4次亚克隆,最终获得3株抗鸭源鸡杆菌脂多糖的杂交瘤细胞株,分别命名为1H11、1B12和4D4。经过长期的体外培养和长期的冻存复苏后,3株杂交瘤细胞分泌抗体的能力略有降低,但仍能均一分泌抗体。间接ELISA方法检测3株杂交瘤细胞上清效价分别为:1:3200、1:6400、1:3200,小鼠腹水效价分别为1:80000、1:100000和1:80000。交叉试验结果显示,所制备的3株单抗与多杀性巴氏杆菌、羊布氏杆菌、鸡福氏志贺菌及大肠杆菌均无交叉反应。经鉴定,3株单抗的亚型分别为IgM、IgG2a、IgG2a。制备的3株能够分泌抗鸭源鸡杆菌脂多糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为鸭源鸡杆菌病原的快速诊断方法的建立及其他相关科学研究提供了技术保障。

论文目录

• 致谢
• 英文缩写表
• 摘要
• 文献综述
• 1 鸡杆菌概述
• 1.1 鸡杆菌分类地位的确立
• 1.2 鸡杆菌的致病性
• 2 鸡杆菌感染检测方法的研究进展
• 2.1 病原学检测
• 2.2 鸡杆菌感染抗体的检测
• 3 革兰阴性菌脂多糖（LPS）研究进展
• 3.1 细菌脂多糖概述
• 3.2 脂多糖的化学结构
• 3.3 脂多糖的生物学功能
• 4 单克隆抗体技术研究进展
• 4.1 杂交瘤技术发展概述
• 4.2 单克隆抗体的概念及特性
• 4.3 单克隆抗体的应用
• 5 小结
• 试验一 鸭源鸡杆菌抗体间接ELISA 检测方法的建立及初步应用
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 鸭源鸡杆菌1-S 株裂解抗原的浓度确定
• 2.2 检测鸭源鸡杆菌抗体间接ELISA 方法的建立
• 2.3 间接ELISA 的初步应用
• 3 讨论与小结
• 3.1 间接ELISA 方法的建立
• 3.2 间接ELISA 方法的初步应用
• 3.3 小结
• 试验二 抗鸭源鸡杆菌脂多糖单克隆抗体的制备与鉴定
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 鸭源鸡杆菌抗原的含量测定
• 2.2 ELISA 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度的确定
• 2.3 间接 ELISA 最佳反应条件的优化
• 2.4 间接 ELISA 方法操作流程的确立
• 2.5 分泌鸭源鸡杆菌脂多糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立
• 2.6 抗鸭源鸡杆菌脂多糖单抗部分性状的鉴定
• 3 讨论与小结
• 3.1 关于鸭源鸡杆菌脂多糖
• 3.2 关于动物免疫
• 3.3 建立检测抗体的方法—间接 ELISA 方法
• 3.4 饲养细胞的制备
• 3.5 细胞融合
• 3.6 杂交瘤细胞的筛选
• 3.7 杂交瘤细胞的亚克隆、冻存和复苏
• 3.8 污染问题
• 3.9 小结
• 全文总结
• 参考文献
• ABSTRACT