鲫鱼PKR-like基因表达特性分析

论文摘要

双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR）是脊椎动物中由干扰素介导的抗病毒防御机制的重要组成部分。鲫鱼抗病毒相关基因（CaPKR-like）则是在鱼类中首次报道的PKR基因同源物。本文一方面从Poly I:C诱导处理的或未处理的鲫鱼中,提取总RNA,通过RT-PCR,检测CaPKR-like在鲫鱼组织中的表达情况;另一方面扩增CaPKR-like C端片段（激酶催化区）,构建重组表达质粒pGEX-KG/CaPKR-like-C,转化大肠杆菌BL21。筛选出的表达菌用IPTG诱导,10%SDS-PAGE电泳。纯化的表达产物作为抗原,免疫家兔。用制备的多抗,通过蛋白免疫印迹法,检测CaPKR-like在鲫鱼各组织以及鲫鱼囊胚培养细胞中的表达情况。 和哺乳类PKR相似,CaPKR-like在未免疫处理的鲫鱼组织中以及正常CAB细胞中低水平的组成型表达。Poly I:C诱导处理后,CaPKR-like的表达量增加。Western blots的结果也证实了这点。以上结果表明:CaPKR-like基因具有与哺乳类PKR很相似的激活和诱导途径。

论文目录

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• 英文摘要
• 缩略语表
• 目录
• 第一章 PKR结构和功能研究
• 1.1 PKR及其结构特点
• 1.2 dsRNA激活的PKR机制
• 1.3 PKR的生物学功能
• 1.4 本项目研究的目的、意义以及主要内容
• 第二章 材料和方法
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 试剂盒、试剂和酶、载体及菌株
• 2.3 实验材料
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 RT-PCR检验CaPKR-like组织表达特性
• 2.4.2 Western blots检测CaPKR-like的表达
• 2.4.2.1 CaPKR-like C端的克隆和原核表达
• 2.4.2.2 CaPKR-like多克隆抗体的制备
• 2.4.2.3 Western blots检测CaPKR-like的表达
• 第三章 实验结果
• 3.1 RT-PCR检验CaPKR-like组织表达特性
• 3.1.1 鲫鱼组织总RNA提取
• 3.1.2 RT-PCR检测CaPKR-like组织表达特性
• 3.2 Western blots检测CaPKR-like的表达
• 3.2.1 CaPKR-like C端原核表达
• 3.2.1.1 CaPKR-like C端cDNA的克隆
• 3.2.1.2 CaPKR like-C端原核表达载体的构建
• 3.2.1.3 CaPKR like-C端原核表达载体的鉴定
• 3.2.1.4 CaPKR-like C端在大肠杆菌中的表达
• 3.2.1.5 CaPKR-like C端原核表达条件优化
• 3.2.2 CaPKR-like C端表达蛋白的纯化
• 3.2.2.1 表达蛋白可溶性分析
• 3.2.2.2 表达蛋白的纯化
• 3.2.3 Western blots检验CaPKR-like细胞及组织表达特性
• 3.2.3.1 Western blots检验CaPKR-like在细胞表达特性
• 3.2.3.2 Western blots检验CaPKR-like组织表达特性
• 第四章 讨论和结论
• 4.1 CaPKR-like基因的表达特性的分析
• 4.2 蛋白免疫印迹中的相关问题
• 4.2.1 CaPKR-like表观分子量
• 4.2.2 多抗制备
• 4.3 原核表达中的一些问题
• 4.3.1 表达载体的选择
• 4.3.2 宿主菌的选择
• 4.3.3 表达菌培养条件的优化
• 4.4 结论
• 参考文献
• 致谢