盐胁迫下不结球白菜幼苗叶片内肽酶同工酶变化及其生化特性研究

论文摘要

内肽酶是细胞内一类十分重要的水解酶,在植物体内它也分布广泛,在植物生长的各个阶段,如在种子萌发,器官衰老以及各种逆境胁迫过程中发挥着重要的作用,尤其在促进蛋白质的周转和再利用,维持细胞的稳态以及参与细胞信号转导中调控蛋白质降解等事件中起直接的作用。目前,国内外对植物的正常生长,如种子萌发和器官衰老等过程中内肽酶同工酶及其功能方面研究较多,而有关植物在逆境胁迫下内肽酶变化方面的研究较少,尤其未见有蔬菜在盐胁迫下内肽酶同工酶的变化和功能研究。同时,外源NO供体SNP的研究也大多集中于NO对植物的缓解作用以及在信号转导中的地位和功能,而SNP对盐胁迫下植物内肽酶的影响未见报道。不结球白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino）是一种非常重要的大众化蔬菜,在我国尤其南方人们日常生活的蔬菜生产和供应上占有十分重要的地位。暑绿（Shulü）是近年培育出的一种优良不结球白菜新品种。本试验以暑绿为材料,主要研究了不同盐浓度胁迫暑绿和SNP缓解盐胁迫下暑绿的幼苗叶片形态、蛋白质含量和内肽酶同工酶活性及特性等变化情况,结果表明:1、盐胁迫下暑绿幼苗叶片内肽酶同工酶变化及其生化特性暑绿幼苗在50、100、150、200、250、300、500 mmol·L-1的不同NaCl浓度胁迫下1天后,结果发现,与对照相比,当盐浓度达到200 mmol·L-1时,叶片明显萎蔫,而且随着盐浓度的增加萎蔫症状也更加逐渐明显;100和200 mmol·L-1NaCl处理时的叶片内肽酶同工酶变化差异较大。为进一步研究盐胁迫与暑绿叶片内肽酶同工酶变化的关系,采取100、200mmol·L-1NaCl处理暑绿幼苗不同时间后发现,在100mmol·L-1NaCl处理的第四天,叶片内肽酶活性较对照有所增强,叶蛋白质含量下降;当在200 mmol·L-1NaCl处理相同天数时,叶片内肽酶活性较对照及100 mmol·L-1处理的更明显增强,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/力口氧酶（Rubisco）等蛋白发生明显降解,叶片走向衰老。结果还发现,暑绿叶片中共有5种内肽酶同工酶（EP1～EP5）,其中EP3和EP5为半胱氨酸型内肽酶,EP1和EP2为丝氨酸型内肽酶,而EP4几乎不被所试的各类内肽酶抑制剂所抑制。内肽酶的最适pH为6.0,最适温度为50℃,各同工酶的热稳定性有较大差异,其中EP3、EP4和EP5的热稳定性较好,在60℃下保温1h还保留较高活性;在100mmol·L-1盐浓度处理的4天中,叶片内EP4活性增强,其它四种同工酶活性变化不明显;当在200 mmol·L-1盐浓度处理时,EP2、EP4、EP5活性明显增强,并随着时间推移活性不断升高,而EP1、EP3活性明显降低。以上结果表示,EP2、EP4、EP5可能在盐胁迫诱导的叶片衰老中起主要作用。2、SNP对盐胁迫下暑绿幼苗叶片内肽酶同工酶的影响200mmol·L-1NaCl胁迫明显抑制了暑绿叶片的生长,但当采用低浓度SNP(25和50μmol·L-1)处理后,发现叶片形态与对照相近;但高浓度SNP(大于100μmol·L-1)处理反而加剧了暑绿叶片的损伤。在单独盐胁迫5天后,暑绿叶片可溶性蛋白质含量降低,仅为CK的76%,内肽酶同工酶种类基本不变,但各同工酶活性都增强;当在低浓度SNP(10、25和50μmol·L-1)范围处理下,叶片内肽酶同工酶活性都逐渐降低,但当SNP浓度大于100μmol·L-1时,叶片内肽酶同工酶活性都逐渐增强。为进一步研究SNP对盐胁迫下暑绿幼苗叶片内肽酶变化的影响,试验采用把盐处理浓度提高至300 mmol·L-1,SNP处理浓度分别为25、50、100、200、400μmol·L-1。结果显示,在单独盐胁迫3天后,暑绿叶片明显开始黄化,Rubisco蛋白明显被降解,内肽酶总活力增加,活性电泳只检测到3种内肽酶同工酶（EP2、EP4和EP5）,其中EP4活性增强,EP2和EP5活性降低或基本不表现出活性;当再加入25μmol·L-1SNP处理后,暑绿叶片早期（第三天前）黄化有所缓解,但是最后不能逆转300 mmol·L-1盐胁迫对叶片的伤害,内肽酶EP2、EP4和EP5活性明显增强;但当SNP大于50μmol·L-1时,叶片损伤更严重,可溶性蛋白质含量明显降低,三种内肽酶同工酶活性都逐渐降低,但仍具有一定的活性,其中只有EP4表现比较稳定。以上研究结果表明,一定浓度的SNP对盐胁迫下暑绿叶片衰老有一定的缓解作用,这种作用具有浓度效应,且与盐胁迫的浓度有关;另外进一步表明了EP2、EP4和EP5在盐胁迫促进叶片衰老的蛋白质降解过程中起重要作用。3、暑绿叶片自然衰老期间内肽酶同工酶的变化为进一步了解不结球白菜暑绿叶片衰老过程中内肽酶的变化情况,对自然衰老过程中内肽酶同工酶和可溶性蛋白含量的变化也进行了研究。研究结果表明,在第四片叶伸出后的第2个星期,叶片中蛋白质的含量达到最高值,此后叶片蛋白质含量开始下降,内肽酶活力逐渐升高,在第6星期后叶片可溶性蛋白质含量仅为最高值的48.8%;不同生长时期第四片叶内肽酶活性电泳显示,EP1和EP2同工酶活性条带由于相互扩散而彼此相连,EP4活性达到最强以至也与EP3相连:Rubisco在衰老后期的降解比较明显,在第5星期后的电泳胶上能清楚的检测到两条Rubisco被降解条带。还研究分析了4叶期暑绿植株不同叶位叶片内肽酶同工酶的差异。试验结果表明,不同叶位叶片中均能检测到5种内肽酶同工酶,但刚伸出的第4张叶中各内肽酶同工酶活性都比较弱,Rubisco含量较低且未发现有降解的现象;第3、第2和第1张叶片中5种内肽酶同工酶活性都比较强,Rubisco被降解现象比较明显,其中第1张叶片（即最早伸出的叶片）中各内肽酶同工酶活性活性都达最强,说明这三种叶片处于不同的衰老进程中。总之,内肽酶EP1、EP2和EP4在暑绿叶片衰老过程中的活性不断增强,而EP3和EP5的活性在衰老后期呈现下降的趋势,因此,EP1、EP2和EP4可能在叶片自然衰老过程中,尤其蛋白质的降解中起主要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词对照表
• 引言
• 文献综述
• 1 植物盐胁迫研究进展
• 2 内肽酶研究进展
• 3 总结和展望
• 第一章 盐胁迫下不结球白菜暑绿幼苗叶片内肽酶同工酶变化及其生化特性
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第二章 外源SNP对盐胁迫下不结球白菜暑绿叶片内肽酶活性及其同工酶变化的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第三章 自然衰老过程中不结球白菜暑绿叶片内肽酶活性及其同工酶变化
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 创新之处
• 存在问题与展望
• 攻读学位期间已发表的论文
• 致谢