乙醇降低大鼠心肌细胞AMPK和GLUT4的表达

论文摘要

背景:胰岛素抵抗（Insulin Resistance,IR）是肥胖等原因导致的机体对胰岛素敏感性降低,从而引起组织细胞糖利用障碍和代谢紊乱。遗传因素和环境因素均可诱导胰岛素抵抗。近年来,随着人们生活水平的提高和生活方式的改变,2型糖尿病发病率逐渐增高,环境因素（如饮酒）对胰岛素敏感性的影响逐渐引起人们广泛的关注。乙醇是目前滥用很广的成瘾物质。长期过量摄入乙醇可对机体产生多方面不利影响,如酒精性肝炎、酒精性心脏病、脂肪肝等,而且与2型糖尿病发病率也呈明显正相关。目前,乙醇影响胰岛素敏感性的具体机制尚未完全阐明。乙醇引起的胰岛素抵抗伴有胰岛素信号传递通路多个环节表达或活性的异常:胰岛素受体（IR）,胰岛素受体底物（IRS）或磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）活性下降,和/或胰岛素与受体的结合能力降低等,这些均被认为可致葡萄糖转运体4（GLUT4）表达下降而诱导胰岛素抵抗。然而仅用胰岛素信号通路不能完全解释乙醇诱导的胰岛素敏感性降低,如胰岛素信号通路功能正常时,某些状态下仍能检测出组织GLUT4表达下降,葡萄糖摄取减少,胰岛素敏感性明显降低,提示存在独立于胰岛素信号通路以外的信号影响GLUT4的表达。AMPK（AMP-activated Protein Kinase）,即AMP激活的蛋白激酶,是哺乳动物细胞内糖脂代谢的一种重要的调节因子。近几年随着对AMPK的研究,发现AMPK在调节代谢和维持能量平衡过程中,参与了调节细胞GLUT4的糖转运,而且这一过程不需要胰岛素信号的介导。有资料表明,AMPK调节GLUT4的表达是通过肌细胞增强因子2（Myocyte Enhancer Factor 2,MEF2）起作用的,磷酸化的AMPK能增加MEF2的基因表达,进而增强其蛋白水平的表达,增加GLUT4基因启动子上MEF2结合序列的活性,增加GLUT4的基因表达。5—氨基咪唑—4-氨基甲酰—1-β-D核糖呋喃腺苷（AICAR）是AMPK的特异性激活剂,已证实其在骨骼肌内可激活AMPK并促进葡萄糖的摄取,但其在心肌内是否发挥类似的作用,目前尚未见报道.乙醇降低骨骼肌和肝细胞AMPK的活性已有报道,但是乙醇是否影响心肌细胞中AMPK对GLUT4的调节,进而影响心肌细胞的胰岛素敏感性,目前未见有报道。目的:1.通过观察AICAR对大鼠心肌MEF2及GLUT4表达量的影响,验证大鼠心肌组织中是否存在AMPK/MEF2/GLUT4通路。2.通过观察乙醇和AICAR刺激下,大鼠心肌细胞AMPKα和GLUT4的表达的变化,探讨乙醇影响心肌细胞胰岛素敏感性的机制。方法:1)动物分组及处理:雄性Wistar大鼠,体重180-200g,随机分为A组和C组,分别处理如下:A组分别皮下注射AICAR（0.8mg/g）,C组皮下注射相应体积的生理盐水。2小时后分别在冰上取心脏。采用RT-PCR分别检测心肌组织MEF2A、MEF2D、GLUT4的mRNA水平。2)原代心肌细胞培养:取1～3天的Wistar大鼠,无菌条件下摘取心脏,在冰D-Hank’s液中漂洗并剪碎心室组织,加入0.125%胰蛋白酶溶液,37℃水浴中消化4～6次,每次消化的上清液以新生牛血清终止消化,静置后将各次上清液以1000r/min离心5min,弃去上清液后将细胞重悬于含20%小牛血清的DMEM培养液中,差速培养两次,以1×105/ml的密度接种于培养板,置37℃、5%CO2培养箱中培养。24h后更换培养液并加入0.5μg/ml丝裂霉素抑制成纤维细胞生长,48h后弃去丝裂霉素,以后每2-3天换液一次。用细胞免疫荧光方法鉴定心肌细胞,心肌细胞纯度为95%左右。将培养的大鼠心肌细胞随机分为三组:乙醇处理组（E组）,AICAR处理组（A组）,正常对照组（C组）。E组给予终浓度100Mm的乙醇,A组给予终浓度1.0Mm的AICAR,C组正常换液。作用四小时后收集细胞,采用RT-PCR及Western Blot分别检测GLUT4的mRNA水平及磷酸化AMPKα亚基（P-AMPKa）的蛋白水平。结果:1)AICAR对大鼠心肌MEF2及GLUT4表达量的影响:RT-PCR结果表明,与正常对照组相比,AICAR明显上调MEF2A的mRNA水平,是对照组的4.9倍（P＜0.01）;GLUT4的mRNA水平也相应升高,是对照组的4.5倍（P＜0.01）。然而,我们未检测到有意义的MEF2D mRNA水平的变化,这与先前报道的心肌组织中MEF2A表达强而MEF2D表达弱相一致。2)乙醇及AICAR对心肌细胞P-AMPK表达的影响:Western Blot结果表明,与对照组相比,乙醇处理组心肌细胞P-AMPKα蛋白水平下降了61.38%（P＜0.05）,而AICAR处理组其蛋白水平升高了74.74%（P＜0.05）。3)乙醇及AICAR对心肌细胞GLUT4表达的影响:RT-PCR结果表明,与正常对照组相比,乙醇处理组心肌细胞GLUT4的mRNA水平降低了30.43%（P＜0.05）,而AICAR处理组GLUT4的mRNA水平升高了7.70%（P＜0.05）。结论:1)AICAR可增强大鼠心肌组织AMPK的活性并增加MEF2、GLUT4的表达,提示大鼠心肌组织中可能存在AMPK/MEF2/GLUT4通路。2)乙醇能降低大鼠心肌细胞AMPK、GLUT4的表达,可推测乙醇损害大鼠心肌细胞胰岛素敏感性的机制之一可能是通过降低AMPK的表达,进而下调GLUT4的表达。

论文目录

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• 结论
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