CD2AP在足细胞中的生理功能研究

论文摘要

第一部分CD2AP在肾脏细胞中的分布及其在足细胞中的作用初探目的观察CD2相关蛋白（CD2AP）在肾脏不同细胞系中的表达分布,及其与足细胞裂孔隔膜分子nephrin和细胞骨架蛋白F-actin之间的联系。方法以DMEM培养基培养人系膜细胞（HMC）和人肾小管上皮细胞系（HK-2）,RPMI 1640培养基培养条件永生化小鼠足细胞系。以RT-PCR及Western blot方法检测足细胞内CD2AP和nephrin的表达。间接免疫荧光结合激光共聚焦方法观察CD2AP在HMC、HK-2、未分化及已分化足细胞中的表达情况,及CD2AP与nephrin在足细胞中的共存。直接免疫荧光结合激光共聚焦方法观察F-actin在足细胞的表达及其与CD2AP的共存。结果CD2AP均匀分布于HK-2及未分化足细胞的核周及胞浆,而不表达于HMC细胞。在足细胞分化过程中,CD2AP的分布发生了变化,出现向周边聚集的现象。CD2AP与足细胞裂孔隔膜分子nephrin及细胞骨架蛋白F-actin在足细胞中存在共定位关系。结论CD2AP表达于上皮来源的肾脏固有细胞。CD2AP在足细胞中的分布特点,提示CD2AP可能参与足细胞的分化过程,并与裂孔隔膜分子功能及细胞骨架调节有关。目的本文旨在研究未分化和分化足细胞生物学性状及CD2相关蛋白（CD2AP）在足细胞分化过程中的作用。方法体外33℃许可条件下培养由H-2Kb-tsA58转基因小鼠所建立的未分化足细胞系,并在37℃非许可条件下诱导其分化。观察足细胞分化后形态学改变;MTT法测定细胞的生长曲线;红色荧光染料PKH-26标记足细胞,追踪其在子代细胞中的分布,检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期的改变;Western印迹检测足细胞相关蛋白CD2AP、α-actinin和足细胞分化相关蛋白nephrin的表达;免疫荧光结合激光共聚焦方法检测CD2AP、nephrin、α-actinin、F-肌动蛋白和微管蛋白的表达变化。用CD2AP siRNA转染未分化足细胞后置于37℃非许可条件下培养,并设非许可条件下未转染组为对照组。检测足细胞的生长速度的变化以及足细胞分化标志物synaptopodin的表达。结果与未分化足细胞相比,分化足细胞形态发生改变,生长速度减慢,增殖能力下降（P<0.05）;细胞周期表现为G0/G1期细胞比例的增多和S期及G2/M期的细胞比例下降（P<0.05）;CD2AP、nephrin和α-actinin的表达明显增高（P<0.05）;CD2AP、nephrin、α-actinin、F-肌动蛋白和微管蛋白在表达分布上均发生明显的改变。synaptopodin仅表达于已分化足细胞,在未分化足细胞无表达。转染特异性siRNA下调CD2AP表达后,细胞生长速度明显减慢,synaptopodin mRNA表达下调（P<0.05）,细胞分化迟滞。结论足细胞分化过程中伴随细胞骨架的重新分布和细胞形态的改变;CD2AP可能作为足细胞裂孔隔膜分子与细胞骨架的连接蛋白,在足细胞分化过程中发挥重要作用。目的观察敲低足细胞CD2相关蛋白（CD2AP）表达对细胞增殖和分裂的影响,探讨CD2AP在足细胞损伤和蛋白尿发病机理中的作用。方法采用RPMI 1640培养基,在33℃许可条件下培养永生化小鼠足细胞系。以PKH-26红色荧光染料标记足细胞后,用Metafectene转染试剂转染针对CD2AP的小分子干扰RNA（siRNA）。转染24h后流式细胞仪检测转染效率;48h后RT-PCR和Western印迹检测转染后CD2AP mRNA和蛋白表达;72h后以流式细胞仪检测足细胞增殖指数及细胞周期;用Oregon Green? 488标记的Paclitaxel直接标记足细胞内的微管蛋白,激光共聚焦显微镜下检测双核及多核足细胞的比例。结果流式细胞仪结果显示,CD2AP特异性siRNA转染效率为66.27%。转染siRNA 48h后,CD2AP mRNA和蛋白表达分别下降57%和39%。转染72h后,足细胞增殖指数明显下降（p<0.05）,G2/M期的细胞数量明显增多（p<0.05）。共聚焦显微镜下可见转染CD2AP siRNA后,部分细胞有丝分裂后不能分离,双核及多核足细胞的比例明显增加（p<0.05）。结论CD2AP表达降低可能通过阻碍足细胞增殖和有丝分裂,导致足细胞损伤。目的观察抑制足细胞CD2相关蛋白（CD2AP）表达对细胞黏附和胞质伸展功能的影响,并初步探讨其机制。方法用RPMI 1640培养基33℃下培养小鼠未分化足细胞系,转染针对CD2AP的小分子干扰RNA（siRNA）,设无特异靶位点的Scrambing序列即Control siRNA转染组作对照。48h后将转染的足细胞制备成单细胞悬液,接种于预铺有Ⅳ型胶原蛋白的96孔板内,33℃下培养90min后检测足细胞的贴壁率和细胞的伸展面积,流式细胞仪检测抑制CD2AP后足细胞的凋亡率以及在不同PAN刺激下足细胞的凋亡率。激光共聚焦显微镜下检测微丝蛋白的分布变化。Western印迹和免疫共沉淀检测nephrin蛋白的表达及其磷酸化水平。结果转染CD2AP siRNA足细胞的黏附率和细胞伸展的面积明显低于对照组（P<0.05）;转染CD2AP siRNA后48h足细胞的凋亡率高于对照组,有统计学意义（P<0.05）。100μg/ml的PAN能明显诱导足细胞的凋亡,减少足细胞的黏附率（P<0.05）。敲低CD2AP的表达后足细胞微丝蛋白的分布发生明显的变化,nephrin蛋白表达和磷酸化水平下降（P<0.05）。结论敲低CD2AP的表达使足细胞易于凋亡,影响细胞的黏附功能;足细胞骨架蛋白的紊乱和nephrin信号通路的抑制可能是足细胞黏附和伸展功能下降的机制。目的观察足细胞对白蛋白的吞噬作用以及白蛋白过负荷对足细胞的损伤,并探讨CD2AP在其中的作用。方法本研究采用化学方法制备FITC标记的白蛋白,在33℃许可条件下培养由H-2Kb-tsA58转基因小鼠所建立的未分化足细胞系,并模拟体内足细胞在肾小球鲍曼氏囊内所处的蛋白尿环境,免疫荧光结合激光共聚焦方法研究足细胞对白蛋白的吞噬功能以及CD2AP与FITC-BSA在足细胞中的共定位,Western印迹检测CD2AP的表达,流式细胞仪检测足细胞的凋亡,透射电镜检测细胞的超微结果变化。结果在生理范围尿白蛋白浓度下（0.05mg/ml）,即可发现足细胞对白蛋白具有吞噬功能。在大剂量白蛋白浓度下（1mg/ml）,足细胞吞噬白蛋白存在时间效应,呈S型曲线,在2h后达到平衡状态。激光共聚焦显微镜证实在CD2AP与FITC-BSA在足细胞内存在共聚关系。BSA刺激12h后CD2AP的表达明显上调,凋亡的足细胞增多,细胞超微结构发生改变。结论除了肾小球滤过屏障作用外,足细胞还对蛋白尿成分具有吞噬清除的功能,CD2AP参与了这一过程。

论文目录

• 前言
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 CD2AP 在肾脏细胞中的分布及其在足细胞中的作用初探
• 参考文献
• 第二部分 CD2AP 在足细胞中的生理功能研究
• 论文1： CD2AP 在足细胞分化中的作用
• 参考文献
• 论文2： CD2AP 在足细胞增殖和分裂中的作用
• 参考文献
• 论文3：CD2AP 在足细胞黏附和胞质伸展中的作用
• 参考文献
• 第三部分 CD2AP 在白蛋白内吞中的作用机制初探
• 参考文献
• CD2AP 在足细胞中的生理功能研究
• 参考文献
• 攻读学位期间发表论文目录
• 致谢