论文摘要
有机磷农药和拟除虫菊酯类农药的使用日益广泛,大量使用和残留造成了环境中含量超标,其中敌敌畏、氧乐果、高效氯氰菊酯、溴甲维磷在体外试验或理论推测中被认为可能具有环境雌激素活性,但其在动物体内的环境雌激素活性尚需进一步证实。目前应用最为广泛的环境雌激素活体筛选指标是鱼类卵黄原蛋白（Vitellogenin, Vtg）,其检测原理是基于Vtg作为抗原能与其抗体发生免疫反应。由于鱼种间Vtg具有较高的种属异质性,有必要根据不同鱼种确定合适的分离纯化方法,将纯化的Vtg作为免疫原用于制备特异性的抗体或抗血清,从而将其应用于环境雌激素的筛选。美国红鱼是沿海重要的增养殖鱼种,可通过水体环境直接暴露于农药等环境污染物。本研究选用美国红鱼为实验动物,确定了美国红鱼Vtg分离纯化方法,研究了其基本性质,制备了美国红鱼Vtg多克隆抗血清,并通过蛋白质免疫印迹评价了敌敌畏、氧乐果、高效氯氰菊酯、溴甲维磷四种常用农药的环境雌激素活性。研究结果表明:采用肌肉注射2μg/g （BW） 17β-雌二醇（E2）诱导美国红鱼两周,取血浆进行Native-PAGE,通过磷、脂、糖特征基团染色,表明E2诱导美国红鱼合成Vtg。Vtg的分离纯化采用两种方案进行,Native-PAGE与SDS-PAGE结果表明选择性沉淀结合离子交换层析与凝胶过滤结合离子交换层析相比,获得的Vtg纯度与得率均高,并且极少发生降解。美国红鱼Vtg天然分子量为560 kDa,进行SDS-PAGE得到176 kDa单体。利用纯化的美国红鱼Vtg免疫昆明小鼠与新西兰兔,采用双向免疫扩散测定多克隆抗血清效价均可达到1:32,Western blot显示多克隆抗血清对Vtg纯品和E2诱导血浆均发生阳性反应,并且阳性条带的位置相同,表明抗血清特异性较高。采用Western blot测定多抗血清（1:600）对美国红鱼Vtg的最低检出限,鼠抗血清为0.90μg/ml、兔抗血清为0.45μg/ml。利用美国红鱼Vtg多克隆抗血清作为第一抗体,辣根酶标记羊抗鼠/兔IgG作为第二抗体,采用Western blot技术定性检测高效氯氰菊酯、溴甲维磷、敌敌畏与氧乐果等四种农药的环境雌激素活性。结果表明:0.01 mg/L、0.1 mg/L和0.5 mg/L高效氯氰菊酯、溴甲维磷、敌敌畏和氯乐果暴露组美国红鱼血浆与多克隆抗血清均发生阳性反应,检测到美国红鱼Vtg-176,表明它们能够诱导美国红鱼合成和分泌Vtg,高效氯氰菊酯与溴甲维磷的拟雌激素效应相对较强,而敌敌畏和氧乐果的环境雌激素活性很弱,尤其是低浓度氧乐果暴露组血浆中几乎检测不到Vtg-176。多克隆抗血清不但能够用于筛选具有拟雌激素活性的农药,而且还可通过与其他鱼类卵黄原蛋白的交叉反应扩展应用范围。本研究发现美国红鱼Vtg多克隆抗血清能够与石鲽Vtg发生交叉反应,对石鲽Vtg-165、Vtg-73具有较强的免疫亲和性,对Vtg-92的免疫亲和性较弱,而与Vtg-106则几乎无交叉反应。本研究建立了快速有效的农药环境雌激素活性筛选体系,可为农药的安全评估、预警机制、相关法律法规的制定和环境无害化管理与处置提供理论依据。