电穿孔介导Kallistatin基因在体内的表达对NCI-H446皮下移植瘤的预防和治疗效果

论文摘要

Kallistatin（Kal）是一种内源性的血管生长抑制因子，具有多种生物学活性，如降血压、舒张血管、促进血管新生内膜的形成、抗炎和抗氧化等。最近的研究表明，Kal具有广谱的抗肿瘤活性，符合抗肿瘤药物应具有多靶点和多信号通路阻断的要求，值得深入开发。电穿孔法转基因是将外源基因通过电场作用导入动物目标组织或器官细胞中的技术。活体电穿孔将编码Kal基因的质粒导入组织内，使其长期表达，达到治疗的效果。目前，国内外关于电转Kal基因治疗肿瘤的报道很少，而电转pAM-CAG-AAV-Kal（pAAV-Kal）治疗H446皮下移植瘤的研究尚未有报道。本研究先进行体外实验。HUVEC转染pAAV-Kal质粒后，相对细胞增殖率和迁移率显著降低，细胞培养基中Kal蛋白表达量最高达到2.5ng/mL。H446转染后，相对细胞增殖率及形态均没有显著变化，转染24h、48h后凋亡细胞的比例显著增加。细胞培养基中Kal的蛋白表达量最高达到56.0ng/mL。A549转染后，相对细胞增殖率显著下降，形态没有变化，转染24h后，凋亡细胞的比例显著增加。培养基中Kal蛋白的表达水平最高达69.0ng/mL。H460转染后，细胞的相对增殖率、形态均无明显变化，转染48h后凋亡细胞比例显著增加。培养基中Kal蛋白表达水平最高达3.6ng/mL。采用正交实验优化电穿孔条件，得到最佳电穿孔条件为：电极距离为6mm，质粒浓度为1.0mg/mL，电极电压为60V，注射次数为2次。采用最佳条件进行电转pAAV-Kal预防H446皮下移植瘤的实验，结果表明电转pAAV-Kal对H446皮下移植瘤没有明显的预防效果。实验对主要的组织，尤其是腿部肌肉组织进行HE染色来评价活体电穿孔对动物可能造成的损伤，同时对肿瘤组织中的Ki-67，CD34和E-cadherin进行免疫组化来评价电转pAAV-Kal对肿瘤的预防效果。电转pAAV-Kal治疗H446皮下移植瘤的结果显示，治疗组的肿瘤体积较对照组明显减小，并且肿瘤组织中也出现大面积的坏死区域。虽然治疗组没有显著降低肿瘤细胞的增殖活性和侵袭能力，但是CD34免疫组化染色结果表明，治疗组肿瘤组织中微血管密度较对照组显著下降。最后，我采用不同频率电转pAAV-Kal治疗H446皮下移植瘤。实验结果表明只有每周进行一次pAAV-Kal电转才能显著的降低肿瘤的体积，免疫组化结果显示每周电转一次能显著降低肿瘤组织中微血管的密度。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 问题的提出
• 1.2 本文的研究背景及意义
• 1.2.1 研究背景
• 1.2.2 研究意义
• 1.3 国内外研究动态
• 1.3.1 Kallistatin 的研究进展
• 1.3.2 肺癌治疗的研究进展
• 1.3.3 活体电穿孔介导基因表达的研究进展
• 1.4 本文的构思
• 1.4.1 实验研究电穿孔介导质粒表达的最优条件
• 1.4.2 实验研究电转介导 pAAV-Kal 对肿瘤的预防效果
• 1.4.3 实验研究电转介导 pAAV-Kal 对肿瘤的治疗效果
• 1.4.4 实验研究电转介导 pAAV-Kal 对肿瘤的量效关系
• 第2章 pAAV-Kallistatin 的鉴定及体外生物活性研究
• 2.1 实验材料、试剂与仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 主要试剂的配制
• 2.2.2 质粒的提取及鉴定
• 2.2.3 细胞培养
• 2.2.4 统计学处理
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 质粒的酶切鉴定
• 2.3.2 pAAV-Kallistatin 对 HUVEC 细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响
• 2.3.3 pAAV-Kallistatin 对 NCI-H446 细胞增殖和凋亡的影响
• 2.3.4 pAAV-Kallistatin 对 A549 细胞增殖和凋亡的影响
• 2.3.5 pAAV-Kallistatin 对 NCI-H460 细胞增殖和凋亡的影响
• 2.4 小结
• 第3章 电穿孔条件的优化
• 3.1 实验材料、试剂与仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 主要试剂的配制
• 3.2.2 正交实验的设计
• 3.2.3 实验动物的分组及给药
• 3.3 实验结果及分析
• 3.3.1 小鼠体内 Kallistatin 在电转后不同时间的表达水平
• 3.3.2 正交实验表
• 3.4 小结
• 第4章 Kallistatin 基因表达对 NCI-H446 皮下移植瘤的预防效果
• 4.1 实验材料、试剂与仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 主要试剂的配制
• 4.2.2 动物模型的建立
• 4.2.3 动物的给药
• 4.2.4 实验取样
• 4.2.5 Kal 对 NCI-H446 皮下移植瘤的生长影响
• 4.2.6 切片检测
• 4.2.7 统计学处理
• 4.3 实验结果与分析
• 4.3.1 Kal 对 NCI-H446 皮下移植瘤的预防效果
• 4.3.2 NCI-H446 肿瘤及裸鼠主要内脏及组织的病理切片
• 4.3.3 肿瘤组织的免疫组织化学染色
• 4.4 小结
• 第5章 Kallistatin 基因表达对 NCI-H446 皮下移植瘤的治疗效果
• 5.1 实验材料、试剂与仪器
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验试剂
• 5.1.3 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 主要试剂的配制
• 5.2.2 动物模型的建立
• 5.2.3 动物给药
• 5.2.4 实验取样
• 5.2.5 Kal 对 NCI-H446 皮下移植瘤的生长影响
• 5.2.6 切片检测
• 5.2.7 统计学处理
• 5.3 实验结果与分析
• 5.3.1 Kal 对 NCI-H446 皮下移植瘤的治疗作用
• 5.3.2 NCI-H446 肿瘤及裸鼠主要内脏及组织的病理切片
• 5.3.3 肿瘤组织的免疫组织化学染色
• 5.4 小结
• 第6章 不同电转方式对 H446 皮下移植瘤的治疗效果
• 6.1 实验材料、试剂与仪器
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验试剂
• 6.1.3 实验仪器
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 主要试剂的配制
• 6.2.2 动物模型的建立
• 6.2.3 动物给药
• 6.2.4 实验取样
• 6.2.5 Kal 对 NCI-H446 皮下移植瘤的生长影响
• 6.2.6 切片检测
• 6.2.7 统计学处理
• 6.3 实验结果与分析
• 6.3.1 Kal 不同电转次数对 NCI-H446 皮下移植瘤的治疗作用
• 6.3.2 NCI-H446 肿瘤及裸鼠主要内脏及组织的病理切片
• 6.3.3 肿瘤组织的免疫组织化学染色
• 6.3.4 血清中 Kal 蛋白的 ELISA 测定
• 6.4 小结
• 总结与展望
• 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在校期间发表论文情况