肉牛RXRG和MyoD1基因的克隆、SNPs筛查及其与肉质和双胎性状的关联分析

论文摘要

本研究分别以秦川牛、鲁西牛、西门塔尔牛和安格斯牛4个品种牛的514份血样和西门塔尔牛的组织样为材料,分别提取基因组DNA和RNA。运用生物信息学方法和同源序列克隆技术结合电子PCR （ePCR）、反转录PCR （RT-PCR）和限制性片段长度多态性PCR （PCR-RFLP）,对牛的视黄素受体γ（RXRG）基因的cDNA序列和基因组DNA序列进行了克隆、鉴定与序列分析。运用测序和PCR-RFLP结合的方法对视黄素受体γ（RXRG）基因和生肌决定因子1 （MyoD1）基因的部分基因组DNA片段进行了单核苷酸多态检测,运用一般线性模型研究了MyoD1基因与上述6个品种牛部分生长与肉质性状的相关性,运用Logistic概率型非线性回归分析和卡方独立性检验研究了RXRG基因与上述6个品种牛双胎性状的相关性,得到了如下结果:（1）利用RT-PCR技术,对牛RXRG基因进行克隆,将得到的片段重组到PMD19-T载体进行序列测定。获得了一个长为1811 bp的cDNA片断。通过氨基酸序列分析发现,牛RXRG基因的该片段由10个外显子组成,编码463个氨基酸。与其他动物同源性比较表明,该基因与人、猪、猕猴、小鼠、大鼠在氨基酸序列上分别有89.5%、93.4%、87.2%、83.9%、85.2%的同源性。获得了牛RXRG基因的cDNA序列。组织表达谱分析表明,牛RXRG基因在肌肉中高度表达,在其他组织中不表达。（2）运用测序法寻找牛RXRG基因SNPs,筛查到一个新的多态位点A1941G,该位点位于3′非编码区。运用PCR-RFLP法验证并分析该位点在鲁西牛双胎群体和单胎群体及西门塔尔牛、安格斯牛和西蒙杂交牛单胎群体间的多态性,结果表明,在鲁西牛双胎和单胎群体中分布A、B两个等位基因,处于中度多态。经卡方适合性检验,鲁西双胎牛群体在该位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态（P<0.05）。将鲁西牛群体的A1941G位点的基因型效应与双胎性状进行关联分析,卡方独立性检测结果显示,基因型分布在鲁西单、双胎牛群体上差异达到极显著水平（P<0.01）。（3）运用测序法寻找牛MyoD1基因SNPs,筛查到一个新的多态位点C1867T,该位点C-T突变引起甘氨酸/丝氨酸的转变。运用PCR-RFLP法验证并分析该位点在不同群体间的多态性,并与相应牛群体的胴体性状进行关联分析。结果显示,西门塔尔牛、鲁西牛群体的C1867T位点的突变达到了Hardy-Weinberg平衡状态,而秦川牛未达到平衡状态。不同基因型对肉牛的背膘厚影响差异极显著（P<0.01）,对大腿肉厚的影响显著（P<0.05）,对日增重、屠宰率、肌间脂肪、大理石花纹、嫩度的影响差异不显著。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 生物信息学与基因组研究概况
• 1.2 基因的电子克隆
• 1.3 候选基因分析方法
• 1.4 牛肉质性状与繁殖性状候选基因的研究进展
• 1.4.1 脂肪酸结合蛋白（Fatty acid-binding proteins，FABPs）基因
• 1.4.2 钙蛋白酶抑制蛋白基因（Calpastatin，CAST）
• 1.4.3 固醇调节元件结合蛋白（Adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1, ADD1）
• 1.4.4 骨形态发生蛋白15 基因（Bone Morphogenetic Protein15, BMP15）
• 1.4.5 生长分化因子9（Growth differentiation factor 9, GDF9）
• 1.5 MYOD1 基因和RXRG 基因的研究现状
• 1.5.1 生肌决定因子I 基因（Myostatin1 ，MyoD1）
• 1.5.2 视黄素X 受体γ（Retinoid X receptor-gamma, RXRG）
• 1.6 研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 用于新基因分离的组织样品
• 2.1.2 用于分子标记的DNA 样品
• 2.1.3 主要试剂及来源
• 2.1.4 主要设备及来源
• 2.1.5 主要分子生物学数据库及软件
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 候选基因cDNA 的克隆
• 2.2.2 候选基因SNPs 的筛查
• 2.2.3 标记与性状的关联分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 RXRG 基因的克隆、鉴定及生物信息学分析
• 3.1.1 总RNA 的提取与检测
• 3.1.2 RXRG 基因的cDNA 克隆与序列鉴定
• 3.1.3 牛RXRG 基因与其他哺乳动物RXRG 基因cDNA 序列的同源性比较
• 3.1.4 组织表达谱分析
• 3.1.5 牛RXRG 基因与其它动物的氨基酸序列的遗传进化树分析
• 3.2 RXRG 基因的遗传变异分析
• 3.2.1 RXRG 基因SNPs 的筛查结果
• 3.2.2 A1941G 突变位点的基因分型结果
• 3.2.3 A1941G 位点的群体遗传学分析
• 3.2.4 RXRG 基因突变位点多态性与单、双胎性状之间的关联分析
• 3.3 MYOD1 基因的遗传变异分析
• 3.3.1 MyoD1 基因SNPs 的筛查结果
• 3.3.2 C1867T 突变位点的基因分型结果
• 3.3.3 C1867T 位点的群体遗传学分析
• 3.3.4 MyoD1 基因C1867T 位点多态性与部分肉质性状的关联分析
• 第四章 讨论
• 4.1 关于牛肌肉组织总RNA 的提取
• 4.1.1 关于样品的采集和保存
• 4.1.2 关于总RNA 的提取过程
• 4.2 关于RT-PCR 技术和PCR 产物的克隆
• 4.3 关于RXRG 基因的克隆
• 4.4 关于SNPS 的筛查与鉴定
• 4.5 关于基因的多态性
• 4.6 SNPS 与生产性状的关联分析
• 第五章 结论
• 5.1 研究结果
• 参考文献
• 英文缩略表
• 致谢
• 作者简介