A型肉毒毒素重组抗原的克隆表达及其ELISA检测试剂盒的制备

论文摘要

肉毒毒素（Botulinum toxin）是由肉毒梭菌（Clostridium botulinum）产生的一种具有神经毒性的蛋白质外毒素,也称肉毒神经毒素（Botulinum neurotoxin,BoNT）,共分A～G 7个血清型。BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E三型毒素主要引起人类的肉毒中毒,BoNT在结构上可分为两部分:轻链为活性结构域,具有锌依赖性金属内肽酶活性,重链为结合和转位结构域。目前,BoNT是重要的毒素战剂和高度危险的生物恐怖剂之一。因此开展BoNT重组抗原片段的研究,为研制ELISA检测试剂盒和疫苗奠定了基础,并具有十分重要的医学和军事意义。 本实验是用重组DNA技术克隆表达了A型肉毒毒素重组抗原,并利用重组抗原免疫鼠和兔,制备了鼠单克隆抗体和兔血清多抗,经过系统的研究,建立了夹心ELISA诊断试剂盒,此试剂盒主要用于临床上肉毒毒素的检测。本试验结果如下: 1.根据密码子简并性原理对其基因序列进行优化,降低基因中的AT含量（73%降至51.8%）,去掉大肠杆菌稀有密码子,并引入限制性酶切位点BamHI、Hind Ⅲ,采用重叠PCR方法进行合成。 2.将肉毒毒素重组抗原基因插入到表达载体pET-his中,构建重组质粒pET-his,分别转化到表达宿主菌BL-21（DE3）中,经IPTG诱导,超声破菌后分离表达的包涵体,并将包涵体蛋白经镍柱亲和层析纯化。 3.以肉毒毒素重组蛋白免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体,经细胞融合、筛选、克隆后得到三株单抗,其亚型鉴定为IgGl,并测定三株单抗的效价在10-4～10-5之间。特异性反应鉴定抗体只与A型肉毒毒素重组抗原片段反应,而不与B型肉毒毒素、葡萄球菌肠毒素等反应。 4.用抗原免疫兔,采取兔血清多抗,并用辛酸硫酸铵法纯化多抗,纯化后抗体效价在10-7左右,并具有较高的特异性。抗体纯化后,用辣根过氧化物酶标记,其标记率较高。 5.用纯化后的单抗作为包被抗体,兔血清多抗作为标记抗体,做成夹心ELISA检测试剂盒,该试剂盒的检测灵敏度为1ng/ml,且特异性强。

论文目录

• 前言
• 1 研究目的和意义
• 2 肉毒毒素研究进展
• 2.1 毒素的来源和分布
• 2.2 肉毒毒素的理化性质和提取方法
• 2.2.1 肉毒毒素的理化性质
• 2.2.2 临床用肉毒毒素的制备
• 2.3 肉毒毒素结构和作用方式
• 2+敏感性'>2.3.1 降低释放机制的Ca²⁺敏感性
• 2.3.2 对胆碱能突触的专一性
• 2.3.3 毒素结合区与其受体
• 2.3.4 L链是酪氨酸特异蛋白激酶的底物
• 2.4 BoNT检测及预防
• 2.4.1 生物学试验方法
• 2.4.2 免疫学试验方法
• 2.4.3 PCR方法
• 2.5 肉毒毒素中毒特点和预防
• 2.5.1 肉毒毒素中毒的临床特点
• 2.5.2 抗肉毒毒素蛋白疫苗的研究
• 第一章 A型肉毒毒素重链C末端保护性抗原的制备
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒和菌株
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 主要液体试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 BoNT／AHc编码序列的优化设计与合成
• 1.2.2 叠式PCR
• 1.2.3 连接反应
• 1.2.4 细菌的转化
• 1.2.5 菌落PCR鉴定阳性克隆
• 1.2.6 酶切鉴定阳性克隆
• 1.2.7 转化表达菌株
• 1.2.8 重组BoNTAHc的诱导表达
• 1.2.9 Ni-NTA亲和层析柱制备
• 1.2.10 重组BoNT／A的亲和纯化与复性
• 1.2.11 Bradford法对重组BoNT／AHc蛋白进行定量
• 1.2.12 重组BoNT／AHc蛋白的鉴定
• 2 结果
• 2.1 BoNT／AHc编码序列的优化设计
• 2.2 BoNT／AHc编码序列的合成与序列分析
• 2.3 重组BoNT／AHc蛋白的表达
• 2.4 重组BoNT／AHc蛋白的纯化和复性
• 2.5 重组BoNT／AHc蛋白鉴定
• 3 分析和讨论
• 第二章 BoNT／A单克隆抗体的制备和免疫学特性鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 仪器设备
• 1.1.3 细胞
• 1.1.4 培养基和缓冲液
• 1.2 方法
• 1.2.1 重组抗原的制备
• 1.2.2 小鼠免疫
• 1.2.3 饲养细胞的制备
• 1.2.4 脾细胞的制备
• 1.2.5 细胞融合
• 1.2.6 融合细胞的培养
• 1.2.7 筛选（Screening）
• 1.2.8 克隆（Cloning）
• 1.2.9 体外扩大培养
• 1.2.10 细胞冻存
• 1.2.11 小鼠腹水制备
• 1.2.12 单抗效价的测定
• 1.2.13 杂交瘤细胞染色体鉴定
• 1.2.14 亚类鉴定
• 1.2.15 腹水单克隆抗体的纯化
• 1.2.16 抗体纯度的鉴定
• 1.2.17 蛋白绝对含量测定
• 1.2.18 单克隆抗体的交叉反应性
• 1.2.19 单克隆抗体的亲和力的测定
• 2 结果
• 2.1 细胞融合
• 2.2 杂交瘤克隆化结果
• 2.3 单抗分类及效价测定
• 2.4 单克隆抗体表位鉴定
• 2.5 抗体亲和力测定
• 2.6 单抗纯化结果
• 2.6.1 纯化得率
• 2.6.2 三株单抗腹水纯化的SDS-PAGE电泳鉴定
• 2.7 稳定性实验
• 2.8 杂交瘤细胞染色体鉴定
• 3 讨论
• 3.1 融合和阳性株筛选
• 3.2 单抗的特异性鉴定
• 3.3 关于单抗的纯化方法
• 3.4 关于三株单抗抗原表位的鉴定
• 第三章 多克隆抗体及酶标抗体的制备与鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 抗原的制备
• 1.2.2 动物免疫
• 1.2.3 抗血清的采集
• 1.2.4 抗血清效价的测定
• 1.2.5 抗血清多抗的纯化
• 1.2.6 特异性鉴定
• 1.2.7 纯化样品鉴定
• 1.2.8 酶标抗体的制备与鉴定
• 2 结果
• 2.1 动物免疫
• 2.2 抗血清的特异性鉴定
• 2.3 抗血清纯化结果
• 2.3.1 SDS-PAGE电泳检测结果
• 3 分析和讨论
• 3.1 酶标抗体的质量鉴定
• 3.2 酶标抗体的纯化
• 3.3 酶结合物的免疫学活性
• 第四章 肉毒毒素（BoNT／A）ELISA检测方法的建立和试剂盒的组装
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 抗体最佳包被浓度的选择
• 1.2.2 抗体最佳包被条件的选择
• 1.2.3 间接竞争ELISA法检测步骤的确定
• 1.2.4 双抗夹心ELISA法检测步骤的确定
• 1.2.5 线性范围及检测限的确定
• 1.2.6 标准曲线的绘制
• 1.2.7 测定人工污染样品中BoNT／A的回收率
• 1.2.8 试剂盒组装和操作
• 2 结果
• 2.1 抗体最佳包被浓度的选择
• 2.2 抗体最佳包被条件的选择
• 2.3 间接竞争ELISA条件的建立
• 2.4 夹心ELISA试剂盒条件分析
• 2.5 试剂盒检测BoNT／A的标准曲线制备
• 2.6 人工污染样品中BoNT／A的回收率
• 2.7 稳定性试验
• 3 分析和讨论
• 3.1 抗体校价确定
• 3.2 抗体的纯度和蛋白含量鉴定
• 3.3 抗体的浓度确定
• 3.4 试剂盒检测的灵敏度
• 3.5 试剂盒检测的特异性
• 3.6 结果判定与计算
• 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 作者简介
• 致谢