牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究

论文摘要

本研究利用屠宰牛的卵巢,先用抽吸法收集卵巢表面直径为2～8mm卵泡液,然后,用切割法获取卵巢表面直径2mm以下的小腔卵泡卵母细胞。对获得的A、B级小腔卵泡卵母细胞进行体外成熟培养、体外受精培养和受精卵的体外培养的研究。实验结果如下:1.本研究探讨了牛卵巢保存温度以及育成牛和经产牛卵巢对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:卵巢保存温度在31～37℃时,可用卵母细胞数和成熟的小腔卵泡卵母细胞数均较多;经产牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟效果好于育成牛。2.比较不同的激素组合（FSH/LH、FSH/hCG和hCG/PMSG）对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:对照组1牛小腔卵泡卵母细胞的成熟率最低（6.52%）,且与第2、3、4相比均差异显著（P<0.05）;第3组卵母细胞的成熟率最高（23.00%）,但与第2、4两组牛小腔卵泡卵母细胞的成熟率间差异不显著（P>0.05）。3.在成熟培养液中分别添加0%、5%、15%和20%的FCS。结果表明:在成熟培养液中添加适量的FCS显著促进牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟（P<0.05）,其中添加15% （v/v）的FCS组的牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟率最高,添加10%（v/v）的FCS组次之,但两者间差异不显著（P>0.05）。4.添加0.05、0.1μmol/mL的β-巯基乙醇均能促进牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟（P>0.05）,但添加0.2μmol/mL的β-巯基乙醇组显著抑制牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟率（P<0.05）,以0.1μmol/mL的β-巯基乙醇组牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟率最高。5.比较不同的直径的卵泡液对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:与对照组1相比,第2组在培养液中添加直径≤2 mm的卵泡卵泡液,卵母细胞的成熟率降低,但二者差异不显著（P>0.05）;第3组在培养液中添加直径2～6mm的卵泡卵泡液显著促进牛小腔卵泡卵母细胞的成熟（P<0.05）,卵母细胞的成熟率最高。6.比较在体外成熟培养液中分别添加不同浓度的LIF和（或）胰岛素对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:在体外成熟培养液中同时添加LIF和胰岛素的I-8组牛小腔卵泡卵母细胞的体外成熟率最高（35.78%）,而单独添加胰岛素的I-6组牛小腔卵泡卵母细胞的体外成熟率最低（22.12%）;I-8组与I-6组间牛小腔卵泡卵母细胞的成熟率差异显著（P<0.05）,但与对照组I-1以及其它各组间成熟率均差异不显著（P>0.05）。7.比较了上浮法和Percoll密度梯度离心法两种精子离心方法对卵泡卵母细胞体外受精的影响,结果表明:Percoll密度梯度离心法预处理的精子卵泡卵母细胞的卵裂率（19.17%）高于上浮法（17.48%）,但两者间没有显著的差异（P>0.05）。8.与对照组相比,和输卵管上皮细胞单层共培养系统的卵泡卵母细胞的卵裂率虽然高一些,但二者间卵裂率没有显著的差异（P>0.05）。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1. 文献综述卵母细胞体外成熟和体外受精的研究进展
• 1.1 卵母细胞体外成熟
• 1.1.1 卵泡的生长和发育及其和卵母细胞的关系
• 1.1.2 卵泡卵母细胞发育成熟的形态学特征
• 1.1.3 卵母细胞成熟的分子调控机理
• 1.1.4 卵泡卵母细胞的获取
• 1.1.5 影响牛卵泡卵母细胞体外成熟的因素
• 1.1.6 小腔卵泡卵母细胞成熟判定
• 1.2 精子体外获能和体外受精
• 1.2.1 精子体外获能的预处理
• 1.2.2 精子获能
• 1.2.3 体外受精
• 1.2.4 体外受精存在的问题和解决的办法
• 1.3 牛哺乳动物体外受精胚胎体外培养
• 1.3.1 中间受体培养
• 1.3.2 细胞共培养
• 1.3.3 细胞培养液
• 1.3.4 卵泡液
• 1.4 小结与展望
• 2. 引言
• 3. 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 卵巢来源
• 3.1.2 主要仪器、设备
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要溶液的配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 小腔卵泡卵母细胞的分离与采集
• 3.2.2 卵泡液的制备
• 3.2.3 输卵管上皮细胞单层的制备
• 3.2.4 小腔卵泡卵母细胞体外成熟培养和检测
• 3.2.5 卵泡卵母细胞体外受精和受精卵体外培养
• 3.2.6 实验设计
• 3.2.7 小腔卵泡卵母细胞成熟和受精卵判定和统计分析
• 4. 结果与分析
• 4.1 卵巢因素对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 4.1.1 卵巢保存温度对小腔卵泡卵母细胞回收率和体外成熟的影响
• 4.1.2 牛年龄对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 4.2 不同的激素组合对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 4.3 胎牛血清浓度对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 4.4 β-巯基乙醇对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 4.5 卵泡液对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 4.6 白血病生长因子（LIF）和胰岛素对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 4.6.1 不同培养液对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 4.6.2 培养时间对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 4.6.3 不同培养方法对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 4.7 精子的不同洗涤方法对卵泡卵母细胞体外受精的影响
• 4.8 输卵管上皮细胞单层共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响
• 5. 讨论与结论
• 5.1 卵巢因素对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.1.1 卵巢保存温度对小腔卵泡卵母细胞回收率和体外成熟的影响
• 5.1.2 牛年龄对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.2 不同的激素组合对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.3 胎牛血清浓度对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.4 β-巯基乙醇对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.5 卵泡液对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.6 白血病生长因子（LIF）和胰岛素对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.6.1 不同浓度 LIF 对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.6.2 胰岛素对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.6.3 LIF 和胰岛素联合使用对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.6.4 培养时间对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.6.5 不同培养方法对牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响
• 5.7 精子的不同洗涤方法对卵泡卵母细胞体外受精的影响
• 5.8 输卵管上皮细胞单层共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响
• 5.9 小结
• 参考文献
• ABSTRACT
• 附录
• 附图