罗汉果二倍体及四倍体遗传变异研究

论文摘要

罗汉果Siraitia grosvenorii （Swingle） C. Jeffrey隶属于葫芦科（Cucurbitaceae）罗汉果属（Siraitia）,为多年生草质藤本植物,是我国特有的药用和甜料植物,具止咳祛痰、凉血舒胃、润肠通便等作用。其主要活性成分为罗汉果甜苷V,具强烈甜味,为蔗糖的300-500倍,具抗氧化、免疫调节及抗癌的作用。罗汉果提取物低热、无毒,是一种纯天然的甜味剂及理想的保健品,可为糖尿病和肥胖病患者使用。罗汉果种子数量多、重量大,占果实鲜重的44%,干重的70%,但几乎不含罗汉果皂苷。因此罗汉果无籽化是罗汉果生产中亟待解决的关键问题,而且无籽罗汉果也成为罗汉果育种研究的热点。2005年本课题组在罗汉果伯林3号和ND的后代中发现一突变株,植株高大,茎粗叶厚,花大败育,后代无籽。本研究首次对罗汉果正常株及其突变株从细胞学、基因组及基因表达水平进行初步探讨,研究罗汉果正正常株与突变株的遗传变异情况及无籽罗汉果基因表达情况。主要研究结果如下：1、染色体核型的研究结果显示罗汉果正常株为二倍体,染色体数目为2n=2x=28,而突变株为四倍体,染色体数目为2n=4x=56,其后代无籽罗汉果为三倍体,染色体数目为2n=3x=42条,同时验证了突变株为四倍体。这是首次对罗汉果多倍体方面进行的报道研究。2、本实验采用SRAP分子标记方法对罗汉果二倍体及四倍体的基因组水平进行遗传变异分析。用196对引物组合对两者的基因组进行扩增,其中9对引物组合未能扩增出条带。筛选得到的189对引物组合共扩增出约4573条带,其中577条（12.6%）为差异条带,1998条（87.4%）为共有条带。大部分引物组合均能扩增出条带,获得的条带长度大多集中在100-800bp之间,平均每对引物组合扩增条带数为12.1。结果表明通过SRAP分子标记方法得出罗汉果二倍体及四倍体株系之间基因组DNA的SRAP多态性较低,遗传差异较小。3、采用SRAP-cDNA方法对罗汉果二倍体及四倍体的基因表达水平进行差异分析。用196对SRAP引物组合对两者的基因表达水平cDNA进行多态性扩增,其中63对引物组合未能扩增出条带。筛选得到的133对引物组合共扩增出约2917条带,其中289条（9.9%）为差异条带,1313条（90.1%）为共有条带。对其中稳定出现的明显差异片段进行回收、克隆及测序,共获得92条差异表达的基因片段,其中77.2%与已知基因具高度同源性,9.8%为编码未知蛋白基因,13.0%为可能的编码新蛋白基因。对已知序列的结果分析发现大多数序列都与光合、呼吸及抗性相关基因具有很高的同源性,其中比较重要的蛋白质如：核铜糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、丙酮酸激酶、过氧化物酶膜转运蛋白、NBS-LRR抗性蛋白、蛋白磷酸酶等。序列的功能分析结果表明已知基因编码蛋白涉及到生物学的诸多方面,其编码的蛋白主要属于：离子通道、信号转导、代谢途径、转录因子、蛋白合成、生长发育、能量代谢等。这些蛋白质在植物生长发育中都起着重要的调节作用,如：锌指蛋白、分子伴侣、促有丝分裂素活化激酶、转录因子IWS1、信号转导蛋白、内膜蛋白、胞外孔道蛋白、纤维素合酶、细胞色素P450、糖基转移酶GT8、氧化还原酶等。以上实验结果从一定程度上表明罗汉果四倍体在抗逆性及光合能力方面更优于二倍体植株。这也为多倍体在表型及生物学方面优于二倍体的现象提供了分子证据。4、利用Solexa高通量测序技术对罗汉果二倍体后代的正常种子及四倍体后代无籽罗汉果干瘪种子进行转录组和表达谱测序。转录组测序结果共得到64372条Unigene,与代谢途径相关的Unigene共17593条。表达谱测序得到87350条reference tags及41678条geneso通过分析发现占mRNA,总量76%-77%的是种类不到5.5%-5.8%的少数nRNA,而占种类58%-62%的mRNA全部加起来不到mRNA,总量的4.2%-4.5%。对差异基因进行比较发现有1748个基因上调,2037个基因下调。本文首次对罗汉果多倍体及其后代无籽罗汉果进行报道研究,并从细胞学、基因组及基因表达水平进行初步探讨,研究罗汉果正正常株与突变株的遗传变异情况及无籽罗汉果基因表达情况。这为多倍体罗汉果及无籽罗汉果形成的遗传机理、种子形成及发育相关基因等方面的研究提供重要的基因资源,也为克隆基因、研究其表达和调控机制及功能提供了基础数据,同时为应用生物技术方法实现罗汉果无籽化,提高生产中罗汉果有效成分提取率提供了技术支持,为培育无籽罗汉果及新资源新品种的开发利用提供理论依据,提高育种的预见性和效率。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 罗汉果研究概述
• 一 罗汉果的生药学研究
• 1 罗汉果的名称
• 2 罗汉果的分类学地位
• 3 罗汉果的分布及生境
• 4 罗汉果的生物学特性
• 5 罗汉果种属鉴定
• 二 罗汉果的化学成分研究
• 1 葫芦烷三萜苷类
• 2 黄酮类
• 3 多糖
• 4 蛋白质
• 5 甘露醇
• 6 脂肪酸类
• 7 其它成分
• 三 罗汉果的药理作用
• 1 镇咳、平喘、祛痰作用
• 2 免疫作用
• 3 抗氧化作用
• 4 降血糖、降血压、降血脂作用
• 5 抗炎镇痛抑菌作用
• 6 抗癌作用
• 7 其它作用
• 8 毒理作用
• 四 罗汉果的应用现状
• 1 医药应用
• 2 保健食品、饮料
• 3 食品添加剂
• 4 甜味剂
• 5 化妆品
• 五 罗汉果研究进展
• 参考文献
• 第二章 罗汉果正常株及其突变株染色体核型分析
• 一 引言
• 1 研究背景
• 2 研究目的及意义
• 3 研究内容
• 二 材料与方法
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 三 结果与分析
• 四 讨论
• 五 结论
• 参考文献
• 第三章 罗汉果二倍体及其四倍体基因组及基因表达差异研究
• 一 引言
• 1 多倍体的概念
• 2 SRAP分子标记技术
• 二 材料与方法
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 三 结果与分析
• 1 DNA及RNA提取的纯度、浓度及完整性检测
• 2 罗汉果二倍体及其四倍体基因组差异分析
• 3 罗汉果二倍体及其四倍体基因表达差异分析
• 4 差异条带的测序及序列分析
• 四 讨论
• 1 SRAP分子标记的可行性及其优势
• 2 罗汉果多倍体基因组差异研究
• 3 罗汉果多倍体基因表达差异研究
• 五 结论
• 参考文献
• 第四章 无籽罗汉果转录组分析
• 一 引言
• 1 第一代测序技术
• 2 第二代测序技术
• 3 第三代测序技术
• 二 材料与方法
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 三 结果与分析
• 1 转录组测序（De novo Transcriptome Assembly）
• 2 表达谱测序（DGE Analysis）
• 四 讨论
• 1 RNA提取方法的改良
• 2 罗汉果研究中高通量测序技术的应用
• 3 高通量测序技术的应用前景
• 五 结论
• 参考文献
• 博士期间发表文章
• 附录
• 致谢