抗CD45单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

论文摘要

目的抗CD45单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析,为进一步的基因工程抗体改造研究奠定基础。方法1.杂交瘤细胞总RNA的提取:以异硫氰酸胍-苯酚-氯仿法提取总RNA。2.引物的设计:利用V区N端相对保守的特点,根据Ig可变区的序列,在N端和恒定区CH1合成5’和3’端兼并的“通用”引物。3. McAbV区基因的扩增:以RNA为模板,采用cDNA合成试剂盒合成第一条链cDNA,以cDNA为模板,用TaqDNA酶扩增McAbV区基因。4. V区基因核苷酸序列分析:用胶回收试剂盒回收PCR产物后,将McAb的VH基因和VL基因分别与pGEM-T载体连接,并转化大肠杆菌,经菌落PCR鉴定阳性菌。每一种连接产物挑取3个阳性菌进行序列分析。5.利用DNAtools,IMGT/QUEST及EBI TOOLS:ClustalW2分析软件对轻链和重链基因分别进行同源性比较。结果1.第一次PCR用2条重链上游引物（MH1,MH2）,一条下游引物（IgG1-C 3’）;轻链上（MK）下（Kc）游各一条引物进行扩增,测序结果获得编码单克隆抗体可变区的核苷酸序列。含引物的VH长397bp,VL长377bp,此次扩增出的基因序列无信号肽序列,适于ScFv的构建,进一步以更换引物进行二次PCR,来扩增含信号肽序列的基因。2.第二次PCR用3条重链上游（VH5’1,2,3）,一条下游引物（IgG1-C 3’）;3条轻链上游（VL5’1,2,3）引物,下游引物（Kc）进行扩增,测序结果:VH为有功能的基因片段,长348bp,编码116个氨基酸,在VH前有57bp的信号肽序列,编码19个氨基酸;含引物的Vκ长369bp,扩增的为非功能性Vκ链。经分析发现扩增出非功能轻链的上游引物为VL5’1,为了扩增出有功能的轻链基因,需重新设计引物。3.第三次PCR用新合成的VL5’4,5取代原轻链上游引物VL5’1,用4条轻链上游引物（VL5’2,3,4,5）,新合成下游引物（VL3’1）,扩增出的Vκ核苷酸序列长333bp,编码111个氨基酸,在Vκ前有57bp的信号肽序列,编码19个氨基酸,经IMGT/QUEST系统分析为有功能的轻链基因。对所扩增的Ig基因进行同源性比较结果:抗CD45单抗有功能的轻链均属于IGκV1-117’01家族;功能性重链属于IGHV2-9-1’01家族。其中扩增出的非功能的轻链属于IGκV3-12’01家族。结论成功获取抗CD45单抗的轻链与重链基因,以及含有信号肽的基因,为进一步通过基因工程技术改造抗体奠定了良好的基础。

论文目录

• 一、英文缩略词
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、前言
• 五、第一部分：材料与方法
• 六、第二部分：结果
• 七、讨论
• 八、小结
• 九、参考文献
• 十、文献综述
• 十一、致谢