胰腺癌体外药物敏感性实验及化疗增敏作用研究

论文摘要

随着循证医学模式的发展，充分利用现有的科学技术，根据病人的具体情况采取个体化的化疗方案是当前肿瘤治疗研究的热点。当前化疗方案的选择多是经验用药，多采用目前认为疗效最佳的化疗方案，这种化疗方案在大样本检验可以是最佳的化疗方案，然而针对于特定的病人，并不总是这种化疗方案最有效，有研究表明，采用个体化的化疗方案能显著提高肿瘤的化疗缓解率。目前筛选化疗方案的方法主要有化疗药物敏感性实验和检测耐药基因的表达。由于体外药物敏感性实验的影响因素众多及实验方法的多样性，目前尚没统一的实验条件和评价体系，因而在评价体外药物敏感性实验的预测准确性一直存在争议。因此，分析胰腺癌体外药物敏感性实验的影响因素，实现实验条件的统一，可以使体外药物敏感性实验的结果更具有可比性，有助于得到较为满意的药物敏感性评价指标。部分胰腺癌病人对大多数化疗药物均不敏感，即便筛选出最优化的化疗方案，仍有可能导致化疗失败。探索化疗增敏作用的方法有助于提高胰腺癌的化疗疗效。目前用于化疗增敏的方法主要有钙离子拮抗剂、反义技术、单抗技术及RNAi技术等。其中RNAi技术是转录后水平的抑制，可联合其他方法在不同水平协同发挥阻遏表达的作用，而且表达的产物不需要特殊修饰，因而结构稳定，抑制效率较高。肿瘤细胞分泌生长因子是导致肿瘤细胞多药耐药的重要机制，PCDGF既可以与EGFR结合调节肿瘤细胞生长增殖，参与耐药机制，还可以调节β-TGF、VEGF、FGF等的表达。因而PCDGF可能是生长因子信号途径中的重要调节因子。在王春友教授和黄韬教授的指导和支持下，我在普外实验室开展了肿瘤体外药物敏感性实验的前期研究工作，我们发现同一种肿瘤细胞在不同的实验条件下其结果可以有很大的差异．国内外在体外药物敏感性实验方法和评价标准上的报道也都有较大的差异。因而要实现通过实验结果准确判断化疗药物敏感性，首先需要统一实验条件，采用合理的评价指标，实现药物之间的可比性。为此，我们综合分析实验条件对结果的影响，得到较为科学的实验条件和评价指标，进一步通过和体内疗效比较，评价体外实验的符合性情况。我们还构建了针对PCDGF的RNAi质粒，评价其作为化疗增敏方法的价值。为提高胰腺癌化疗疗效提供实验数据和理论基础。第一部分胰腺癌细胞的原代分离纯化和初步鉴定目的：探讨胰腺癌原代细胞分离的方法和难点，研究能稳定分离出胰腺癌原代细胞的方法，为胰腺癌原代细胞体外药物敏感性实验提供纯化的原代细胞。方法：采用胶原酶消化法对新鲜的手术切除的胰腺癌组织进行消化，过滤，再用差数贴壁法去除部分杂质细胞，经免疫组化检测粘蛋白的表达以鉴定分离纯化后的细胞成分。结果：23例胰腺癌组织经消化后，17例成功分离到胰腺癌原代细胞并稳定生长，经差数贴壁纯化后，免疫组化检测到上皮来源的细胞占所有细胞的比例为（85±7）％。结论：胶原酶消化法和差数贴壁法可以很好的获得胰腺癌原代细胞，为胰腺癌体外药敏实验提供对象。第二部分胰腺癌体外药物敏感实验的影响因素及评价体系的建立目的：体外药物敏感性实验影响因素众多，包括备筛选药物的浓度作用时间，接种细胞密度，混杂细胞和加药物的时间等，通过本研究统一控制体外药物敏感性实验的影响因素，使体外药物敏感性实验结果在不同的病人和不同的药物之间更具有可比性，并分析如何实现药物的筛选。材料和方法：以胰腺癌细胞系Panc-1和ASPC-1为研究对象，利用MTT法检测健择、丝裂霉素和5-FU在不同浓度和作用时间下对2株细胞系的抑制率，分析药物的浓度和时间对药物抑制率的影响，利用正交分析方法分析其他因素对实验结果的影响，为统一制定体外实验的标准提高药物之间的可比性提供科学依据。结果：健择对Panc-1和ASPC-1的生长抑制率随着药物浓度的增加而升高，5-FU对2株细胞系的杀伤是时间依赖性的，丝裂霉素对2者杀伤受时间和浓度双重影响。加药时刻、接种细胞密度及细胞纯度对实验结果均有较大的影响（p＜0.05）。结论：经MTT法测定的细胞抑制率受较多因素的影响，通过MTT测定的抑制率评价药物的敏感性必须控制影响因素在一定的范围内。第三部分体外药物敏感性实验筛选化疗药物的疗效评价目的：目前认为胰腺癌常用的和有效率最高的化疗药物是健择，通过化疗药物敏感实验对常用的化疗药物对健择、丝裂霉素和5-FU进行筛选，当筛选出的化疗方案和传统方案不同时，比较筛选出的化疗方案是否优于经验用药，评价体外药物敏感实验的价值。方法：利用MTT法测定各种药物对不同胰腺癌细胞系和胰腺原代细胞的抗肿瘤作用(IC50)，利用IC50/PPC对药物的敏感性进行排序，体外筛选出最敏感化疗药物，然后接种至裸鼠体内，评价体外药敏实验组和传统化疗组的疗效。结果：通过药物筛选的结果显示有6例原代细胞和ASPC-1筛选出最敏感药物是5-FU，3例最敏感药物为MMC，其余为健择。10种接种至裸鼠后分三组进行，采用药物筛选的化疗药物进行治疗的疗效优于单用健择的方案（p=0.034）。结论：利用化疗药物敏感实验进行药物筛选选择的化疗方案优于传统的化疗方案。第四部分PCDGF shRNA增强胰腺癌细胞系Panc-1对健择敏感性的研究目的：胰腺癌是恶性程度非常高的恶性疾病，手术切除率低，以健择为主的化疗方案在胰腺癌的研究中正在兴起，本文通过转染PCDGF shRNA至胰腺癌细胞系Panc-1，观察对健择敏感性的变化，分析PCDGF因子对化疗药物敏感性的影响。材料和方法：免疫组化和定量PCR测定PCDGF在胰腺癌组织中的表达，构建含2条shRNA的RNAi质粒，脂质体转染PCDGF shRNA至胰腺癌细胞系Panc-1，测定转染前后细胞对健择敏感性的变化。结果：PCDGF表达于多数胰腺癌细胞的细胞浆中，定量PCR结果显示胰腺癌组织PCDGF的表达明显高于胰腺囊腺瘤和胰腺炎（t=11.41，p＜0.05），构建PCDGF shRNA质粒经脂质体转染后PCDGF的表达显著受到抑制（抑制率为82.3％），在较高浓度时，健择的细胞毒作用明显增强。结论：针对PCDGF的shRNA能显著增加胰腺癌细胞系Panc-1对健择的敏感性。小结本研究通过对体外药物敏感性实验影响因素的分析旨在尽可能统一实验过程中的可控性因素，使实验结果更具有可比性，探讨体外药物敏感性实验对化疗的指导价值，为实现个体化化疗提高胰腺癌化疗疗效提供科学依据，此外采用RNAi技术增强化疗药物的敏感性，综合提高胰腺癌的化疗疗效。通过本实验我们得到以下结论和创新点：1．胶原酶消化法可以快速获得大量胰腺癌细胞团，采用反复贴壁法和细胞刮除等方法可以得到较为纯化的胰腺癌原代细胞；2．胰腺癌体外药物敏感性实验的实验结果受多个实验条件的影响，如：细胞纯度、接种时间、药物接触浓度和时间以及接种细胞密度等，控制条件测定IC50/PPC可以较为满意的评价药物之间的敏感性；3．通过体外药物敏感性实验进行化疗药物的筛选，采取个体化的化疗方案能提高化疗的疗效；4．生长因子是当前增强化疗药物敏感性的新兴位点，PCDGF一方面阻断IGFR途径，同时还可以影响TGF、FGF、VEGF等的表达，因此PCDGF可以作为化疗增敏的位点，RNA技术可以稳定的抑制PCDGF的表达，针对PCDGF的ShRNA可以显著增强健择对胰腺癌的抑制生长作用。5．本研究在目前国内体外药物敏感性研究的基础上，提出要统一实验条件，采用IC50/PPC作为评价指标，将使体外药物敏感性实验的结果更具有可比性。6．以生长因子信号途径作为化疗增敏的作用位点，采用个体化化疗方案以及化疗增敏治疗手段可以尽可能最优化化疗的疗效。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文部分
• 前言
• 第一部分 胰腺癌细胞的原代分离纯化和初步鉴定
• 第二部分 胰腺癌体外药物敏感实验的影响因素及评价体系的建立
• 第三部分 体外药物敏感性实验筛选化疗药物的疗效评价
• 第四部分 PCDGF ShRNA增强胰腺癌细胞系Panc-1对健择敏感性的研究
• 综述
• 英文缩略词表
• 博士期间发表的论文
• 致谢