论文摘要
背景:目前,在评价药物抗脑缺血损伤作用时,常常采用脑缺血后一系列形态学指标、生化指标的变化来反映药效,较少关注药物对缺血性脑卒中引起的肢体运动功能障碍是否有改善作用,而这恰恰是脑缺血临床治疗中关心的问题。因此有必要建立一套行为测试体系,评价实验性缺血性脑卒中动物肢体的运动能力,从而反映神经血管的修复程度。目的:尝试建立一套行为测试方法,探讨其中两种方法即托盘作业箱及抓取测试盒评价局灶性脑缺血大鼠受累前肢精细运动功能的可行性及有效性。评价梓醇对局灶性脑缺血大鼠神经行为的影响。观察梓醇不同给药剂量对各组大鼠血管生成素1（Ang-1）、血管生成素受体（Tie-2）蛋白表达的影响,分析梓醇促局灶性脑缺血大鼠新生血管成熟机制。方法:1、托盘作业箱的制备及评分标准托盘作业箱制备方法:参照文献方法,改进,制备。测试箱为一长40cm,宽28cm,高26cm的铁笼。铁笼正面的竖铁栏杆之间的距离为0.9cm,左边有小铁门,供大鼠的进入。铁笼正前面栏杆的底部安装有一宽3cm,深1cm的托盘。测试时,将托盘内装满市售黑米瓜籽,供大鼠伸前肢穿过栏杆空隙自由抓取。托盘作业箱测试评分标准:测试10min内大鼠抓取瓜籽的6个连续动作,即:（1）伸前肢至食物上方;（2）足趾打开倒腕抓取;（3）紧握食物;（4）肢肘回收;（5）两前肢与嘴配合剥壳;（6）双后肢后蹲,两前肢捧食物咀嚼。一次性完成6个连续动作记一次“成功抓取（hit）”;上述六个环节任一环节失败,则记为“伸爪（reach）”。将训练期间最后三次的“伸爪”次数、“成功抓取”次数的平均值作为每只大鼠在造模前的“抓取成功率基线值”。按以下公式计算:成功率=（“成功抓取”次数/“伸爪”次数）×100。将达到下列标准的纳入造模范围:（1）习惯性使用左前肢,即“左利手”大鼠;（2）10min抓取成功率大于或约等于65%。该方法在造模前1d及造模后2d、4d、7d、15d、21d进行评定。2、抓取测试盒的制备及评分标准抓取测试盒制备方法:测试盒用厚5 mm的压克力板制成。主体包括三部分:通道主体、抽屉式食槽和防滑斜坡。通道长25cm,宽6cm,高5cm,大鼠可无阻碍通过,但转身困难。通道两端有抽插门,便于大鼠进入,测试时将一侧抽插门打开,另一侧关闭。在通道底板的两长边各有宽1cm的平行缝隙。该缝隙下面是食槽,食槽深为3cm,长为15.5cm,其一端有密封仓,迫使大鼠进入通道内抓取黑米瓜籽。通道两端抽插门处有与地面成30°的防滑斜坡,便于大鼠爬入通道,同时可观察大鼠前肢的抬举动作。大鼠进入通道后,只能用一侧前肢通过底板的缝隙抓取下面食槽中的黑米瓜籽。抓取测试盒测试评分标准:测定10min内大鼠抓取瓜籽过程的6个连续动作,即:（1）伸前肢至食物上方;（2）足趾打开倒腕抓取;（3）紧握食物;（4）肢肘回收;（5）两前肢与嘴配合剥壳;（6）双后肢后蹲,两前肢捧食物咀嚼。一次性完成6个连续动作记一次“成功抓取（hit）”上述六个环节任一环节失败,则记为“伸爪（reach）”。训练期间最后三次的“伸爪”次数、“成功抓取”次数的平均值作为每只大鼠在造模前的“抓取成功率基线值”。按以下公式计算:成功率=（“成功抓取”次数/“伸爪”次数）×100。将达到下列标准的纳入造模范围:（1）习惯性使用左前肢,即“左利手”大鼠;（2）10min抓取成功率大于或约等于65%。该方法在造模前1d及造模后2d、4d、7d、15d、21d进行评定。3、平衡木的制作及评分标准平衡木的制作:模具用木材制成,分为三个部分:平衡木,支架,平台。平衡木为长80cm,宽2.5cm,高2.5cm的方木棒,行走面光滑。两支架位于平衡木外1/3处,平衡木被升高到距离地面1m处,下方固定。平台为长25cm,宽25cm的小方盒,为平衡木的起始处和终点处。平衡木测试评分标准:即0分:穿过平衡木,不会跌倒;1分:穿过平衡木,脚滑现象小于50%;2分:穿过平衡木,脚滑现象大于50%;3分:能穿过平衡木,但瘫痪侧后肢不能帮助向前移动;4分:不能穿过平衡木,但可坐在平衡木上面;5分:将大鼠放在平衡木上会掉下来。将达到下列标准的纳入造模范围:（1）每次能流畅的通过平衡木,在平衡木上没有习惯性停留的大鼠;（2）行走姿势符合标准,即:背部略往上拱,尾巴上翘。该方法在在造模后2d、4d、7d、15d、21d进行评定。4、动物分组、造模及抓取测评方法可行性考察实验动物分组:取大鼠15只,随机分为5组,即正常组、假手术组、模型组、生理盐水组、胞二磷组,按文献标准方法给食。局灶脑缺血大鼠模型制备:将达标大鼠纳入造模范围。采用右颞侧低位开颅,电凝右侧嗅束与大脑下静脉之间的一段大脑中动脉,制备永久性局灶性脑缺血模型。托盘作业箱及抓取测试盒测评方法学考察:选择规格为250mg/2ml,剂量为0.4g.kg-1的胞二磷胆碱注射液,用生理盐水配制,每次给药总体积为3ml,生理盐水组给予等量体积,腹腔注射。模型组与假手术组大鼠不给药。给药时间从造模后24h开始,连续给药7天。第2、4、7、14及21d,用托盘作业箱评定各组大鼠左前肢（即受累肢）抓取瓜籽的能力。用摄像机连续拍摄大鼠抓取动作,输入计算机,分析并计算每只大鼠的抓取成功率。5、梓醇药效评价实验动物分组:取大鼠60只,随机分为7组,即生理盐水组、模型组、假手术组、胞二磷0.4g.kg-1组（阳性对照）、梓醇1mg.kg-1、3mg.kg-1、5mg.kg-1组。按文献标准方法给食。局灶脑缺血大鼠模型制备:将达标大鼠纳入造模范围,保证每组7只。采用右颞侧低位开颅,电凝右侧嗅束与大脑下静脉之间的一段大脑中动脉,制备永久性局灶性脑缺血模型。梓醇对局灶脑缺血大鼠神经行为的影响:腹腔注射梓醇、胞二磷胆碱和等量溶媒生理盐水。模型组与假手术组大鼠不给药。给药时间从造模后24h开始,连续给药7天。按照先前所阐述的各行为方法的测试时间点,对各组大鼠分别采用Bederson神经功能评分、托盘作业箱、抓取测试盒、平衡木四种测试方法进行评定。用摄像机连续拍摄大鼠行为,输入计算机,分析每只大鼠行为测试结果,评价不同剂量梓醇的药效。病理组织学HE染色观察:第21天行为测试完毕,灌流固定,断头取脑,制作石蜡切片,用于HE。6、梓醇对新生血管成熟标志性蛋白Ang-1及受体Tie-2表达的影响第21天行为测试完毕,灌流固定,断头取脑,制作石蜡切片,用于免疫组化检测Ang-1、Tie-2。严格按Western blot检测方法取材,采用Western blot方法检测梗死灶周围大脑皮层中Ang-1蛋白的表达量。结果:1、托盘作业箱测评方法学考察结果模型组、生理盐水组、胞二磷胆碱组在造模后第2d,抓取成功率明显下降,下降为1.8 %±1.3 %～1.8 %±1.7 %,组间无统计差异（P>0.05）。模型组在术后2、4、7、15、21d的抓取成功率与模型组基线值比较有所下降,差异显著（P<0.05）,第21d大鼠受累前肢自行恢复程度为造模前的35%。胞二磷胆碱组在7、15、21d的抓取成功率分别与模型组比较有所上升,差异显著（P<0.05）,第21d的恢复程度达到造模前的44%。提示托盘作业箱能有效反映大鼠受累前肢水平层面的抓取能力以及胞二磷胆碱促神经功能修复的有效性。2、抓取测试盒测评方法学考察结果模型组、生理盐水组、胞二磷胆碱组在造模后第2d,抓取成功率明显下降,下降为1.9%±1.9%,组间无统计差异（P>0.05）。模型组在术后2、4、7、15、21d的抓取成功率与模型组基线值比较有所下降,差异显著（P<0.05）,第21d大鼠受累前肢自行恢复程度为造模前的32%。胞二磷胆碱组在4、7、15、21d的抓取成功率分别与模型组比较有所上升,差异显著（P<0.05）,第21d的恢复程度达到造模前的49%。提示抓取测试盒能有效反映大鼠受累前肢垂直层面的抓取能力以及胞二磷胆碱促神经功能修复的有效性。3、梓醇对局灶脑缺血大鼠神经行为的影响Bederson神经功能评分:术后15、21d,梓醇3mg.kg-1和5mg.kg-1组分别与模型组比较,分值较低,神经症状不明显,差异有统计差异（P<0.05）。托盘作业箱测评:模型组、生理盐水组、梓醇治疗组和胞二磷胆碱组术后2d,大鼠抓取成功率明显下降,各组抓取成功率降为2.4%±2.2%,组间比较,差异无显著性（P>0.05）。术后7d,各实验组大鼠受累前肢抓取成功率明显升高,模型组为15.2%±4.5%,梓醇1mg.kg-1、3mg.kg-1、5mg.kg-1组分别为19.1%±5.6%、30.2%±7.3%、24.2%±6.6%,其中梓醇3mg.kg-1、5mg.kg-1组与模型组比较,差异具有显著性（P<0.05）。术后15d,各组大鼠左前肢抓取功能仍在恢复,梓醇3mg.kg-1、5mg.kg-1组明显比模型组的恢复程度高,差异具有显著性（P<0.05）。术后21d,模型组受累前肢抓取成功率恢复至25.2%±4.2%,约相当于基线值的37%;梓醇3mg.kg-1组为42.8%±4.1%,约为基线值的65%;梓醇5mg.kg-1组为43.9%±5.3%,约为基线值的66%,与模型组比较,差异有显著性（P<0.05）。抓取测试盒测评:模型组、生理盐水组、梓醇治疗组和胞二磷胆碱组术后第1d,大鼠抓取成功率明显下降,降为1.7%±1.5%～1.8%±1.4%,组间差异无显著性（P>0.05）。术后第7天,各实验组大鼠受累前肢抓取成功率明显升高,其中,模型组为15.5%±2.0%,梓醇1mg.kg-1、3mg.kg-1、5mg.kg-1组分别为20.2%±5.0%、26.8%±4.1%、30.7%±3.4%,梓醇1mg.kg-1、3mg.kg-1、5mg.kg-1组与模型组比较,差异有显著性（P<0.05）。术后15d,梓醇1mg.kg-1、3mg.kg-1、5mg.kg-1组恢复程度明显高于模型组,差异具有显著性（P<0.05）。术后21d,模型组受累前肢抓取成功率恢复至26.1%±1.1%,约为基线值的39%,梓醇1mg.kg-1组为46.7%±2.2%,约为基线值的68%,梓醇3mg.kg-1组为50.6%±1.2%,约为基线值的75%,梓醇5mg.kg-1组为52.1%±2.7%,约为基线值的76%,与模型比较有显著性差异（P<0.05）。平衡木测试:术后15d和21d,梓醇3mg.kg-1、5mg.kg-1组得分明显低于模型组,差异有显著性（P<0.05）。4、病理组织学HE染色:光镜下,假手术组大鼠神经细胞形态无异常,胞膜、核膜清晰,核仁明显,血管管腔形态完整。模型组及梓醇治疗组大鼠梗死灶的中心脑组织疏松,空泡样变明显,神经细胞固缩呈三角形,胞浆嗜伊红,细胞核固缩深染,核仁消失,残存细胞多无完整的细胞结构。梓醇治疗组梗死灶周围皮质血管有相对完整的管腔形态结构,模型组梗死灶周围皮质血管管腔形态各异,无相对完整形态结构。5、梓醇对新生血管成熟标志性蛋白Ang-1及受体Tie-2表达的影响Ang-1在局灶脑缺血大鼠梗死灶周围的表达:第21d,Ang-1免疫组化的结果分析:大脑皮层Ang-1蛋白的IOD值假手术组为16.25±0.06,模型组为87.77±0.17,比较有统计学差异（P<0.05）,提示造模后第21d,Ang-1有表达。梓醇1mg.kg-1、3mg.kg-1、5mg.kg-1剂量的Ang-1蛋白的IOD值分别为131.62±0.13,163.77±0.21、172.81±0.33,分别与模型组比较有显著性差异（P<0.05）,提示梓醇上调脑缺血大鼠Ang-1蛋白的表达。Tie-2在局灶脑缺血大鼠梗死灶周围的表达:第21d,Tie-2免疫组化的结果分析:大脑皮层Tie-2蛋白的IOD值假手术组为15.20±0.08,模型组为82.81±0.05,比较具有显著性差异（P<0.05）,说明造模后第21d,Tie-2有表达。梓醇1mg.kg-1、3mg.kg-1、5mg.kg-1剂量的Tie-2蛋白的IOD值分别为133.76±0.14,168.79±0.07、173.85±0.22,分别与模型组比较有显著性差异（P<0.05）,提示梓醇上调脑缺血大鼠Ang-1的受体Tie-2蛋白的表达。Ang-1在局灶脑缺血大鼠梗死灶周围的相对表达量:第21d,Ang-1的Westen blot半定量分析显示,梓醇1mg.kg-1、3mg.kg-1、5mg.kg-1组Ang-1蛋白表达水平明显高于模型组,具有显著差异（P<0.05）;模型组、生理盐水组、Ang-1蛋白表达水平组间差异无显著性（P>0.05）,模型组同假手术组比较有统计学差异（P<0.05）。此变化趋势与Ang-1免疫组化检测结果相佐。进一步提示梓醇对局灶脑缺血大鼠Ang-1蛋白表达有上调作用。结论:1.托盘作业箱与抓取测试盒实验方法稳定、有效,能对脑卒中大鼠受累前肢抓取瓜籽的精细动作做客观评价,可作为药物效果观察及评价单纯肢体障碍程度的实验技术平台。2.Bederson神经功能评分、托盘作业箱测评、抓取测试盒测评、平衡木测试,包括了神经症状、细微运动协调、感觉运动整合,即由简单到复杂的神经行为测试指标,为进一步构建脑缺血大鼠行为测试体系提供实验思维和实验基础。3.梓醇能提高局灶性脑缺血大鼠Bederson神经功能评分、托盘作业箱测评的抓取成功率、抓取测试盒测评的抓取成功率、平衡木行走测试的成功率,对局灶性脑缺血大鼠肢体运动功能的恢复具有显著促进作用。4.梓醇上调Ang-1及其受体Tie-2的表达,促进局灶性脑缺血大鼠新生血管的成熟。