果蝇乙酰胆碱酯酶基因在毕赤酵母中的表达初探

论文摘要

农药的使用在一定程度上保障了农业的收成,但是随着农药的使用越来越广泛,再加上不合理利用农药,造成了对环境的污染,给生物的生存带来了威胁,因此,有必要对环境及农产品的农药残留检测进行及时的监测。传统的农药残留检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法等,这些检测方法精确并且能够定量,但需要昂贵的设备和受过良好培训的操作人员,不适合中国国情,因此,有必要开发一种方便快捷、廉价并且适合现场检测的农药残留检测方法。乙酰胆碱酯酶（Acetycholinesterase, AChE, EC 3.1.1.7）是存在于中枢神经系统内的一种水解酶,经典作用是水解神经递质乙酰胆碱（ACh） ,终止神经冲动的传导。常见的残留农药主要是有机磷和氨基甲酸酯类药剂,通过抑制昆虫中枢神经中的胆碱酯酶使之死亡而发挥杀虫作用。因此,AChE作为此类农药的最适反应底物,在农药残留的快速检测中得到了广泛应用,尤其是基于AChE的生物传感器已成为农残检测研究中的热点。目前,AChE主要从昆虫或动物血液中提取,产量低,成本高、灵敏度变化幅度大,严重阻碍了AChE在农药残留检测中的应用。随着基因工程技术的发展,我们可以通过克隆敏感AChE基因,使其在外源表达系统中高效表达来解决乙酰胆碱酯酶的酶源问题。果蝇AChE （Drosophila melanogaster AChE, DmAChE）对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感度极高,并且已经得到该基因的全长核苷酸序列。毕赤酵母（Pichia pastoris, P.pastoris）表达系统不但能够产生有活性的外源蛋白,而且具有易于高密度发酵,表达基因稳定整合在宿主基因组中,能使产物有效分泌并适当糖基化,培养方便经济等特点。因此,我们构建了DmAChE的毕赤酵母表达系统,对DmAChE基因在毕赤酵母中的表达进行了初步探索。研究DmAChE基因在毕赤酵母Km71中的表达,设计并合成引物Pp1/Pp2和DmAC1/DmAC2,分别用PCR扩增出DmAChE基因的整个开放阅读框及去掉了糖磷脂锚定位点（GPI）的DmAChE基因;选取毕赤酵母表达载体pPIC9K,选用SnaBI/NotI内切酶把DmAChE基因克隆于表达载体的多克隆位点上,构建重组质粒pPIC9K-DmAChE。重组质粒经PCR验证并且测序后,采用电穿孔法转化入毕赤酵母表达菌株KM71,PCR方法检测重组情况,筛选阳性转化子。对重组酵母进行诱导表达,应用改良的Ellman法检测表达产物的AChE活性,结果证明,去除了GPI的DmAChE可以在酵母中有效地分泌表达,而全长DmAChE基因则不能在酵母中有效地分泌表达。对不同基因拷贝数转化子表达产物的乙酰胆碱酯酶活性作了初步比较,结果证明拷贝数与表达量不存在正相关的关系。筛选到一株高表达菌株DmAChE-331,其表达量在168hr时达到37.5U/mL。通过His-tag纯化发现,DmAChE在酵母中表达有两种加工方式。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 农药残留检测方法研究进展
• 1.2.2 乙酰胆碱酯酶的研究进展
• 1.2.3 乙酰胆碱酯酶基因的异源表达系统研究进展
• 1.3 立论依据
• 1.4 研究目的
• 1.5 研究内容及技术路线
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒、菌株
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 主要溶液配制
• 2.1.4 试验设备
• 2.2 DmAChE 全长基因在毕赤酵母中的表达
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 Dm AChE1 基因的PCR 扩增
• 2.2.3 pPIC9K-DmAChE1 重组表达质粒的构建
• 2.2.4 P.pastoris/pPIC9K-Dm AChE1 工程菌株的构建与筛选
• 2.2.5 重组KM71 的表达
• 2.3 去除了 GPI 的 DmAChE 基因在毕赤酵母中的表达
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 Dm AChE1 基因的PCR 扩增
• 2.3.3 pPIC9K-DmAChE2 重组表达质粒的构建
• 2.3.4 P.pastoris/pPIC9K-Dm AChE1 工程菌株的构建与筛选
• 2.3.5 重组KM71 的表达
• 2.3.6 高表达菌株的筛选
• 2.3.7 表达条件的优化
• 2.3.8 重组DmAChE2 的纯化
• 3 结果与分析
• 3.1 DmAChE 全长基因在毕赤酵母中的表达
• 3.1.1 Dm AChE1 基因的扩增和毕赤酵母表达载体的构建
• 3.1.2 P.pastoris/ pPIC9K-DmAChE1 工程菌株的筛选与鉴定
• 3.1.3 重组毕赤酵母的诱导表达及酶活测定
• 3.2 去除了 GPI 的 DmAChE 基因在毕赤酵母中的表达
• 3.2.1 Dm AChE2 基因的扩增和毕赤酵母表达载体的构建
• 3.2.2 P.pastoris/ pPIC9K-DmAChE2 工程菌株的筛选与鉴定
• 3.2.3 重组毕赤酵母的诱导表达及酶活测定
• 3.2.4 高表达菌株的筛选
• 3.2.5 表达条件的优化
• 3.2.6 重组DmAChE2 的纯化
• 4 讨论
• 4.1 P.pastoris 表达系统
• 4.2 影响 DmAChE 在毕赤酵母中表达的因素
• 4.2.1 基因剂量对表达量的影响
• 4.2.2 酵母自身分泌的蛋白酶对表达量的影响
• 4.2.3 GPI 对表达的影响
• 4.2.4 密码子偏好性对表达量的影响
• 4.2.5 RNA 的二级结构对表达量的影响
• 4.3 提高外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达量的途径
• 4.3.1 优化基因内部结构
• 4.3.2 分泌信号的改造
• 4.3.3 选择高表达的启动子
• 4.3.4 优化培养条件
• 4.4 DmAChE 的纯化过程中存在的问题
• 5 结论与后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录