论文摘要
胆碱能抗炎通路（the cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP）是近些年来发现的以传出性迷走神经为基础的抑制炎症反应的神经免疫通路。直接刺激迷走神经可以激活此通路,使传出性迷走神经冲动增加,释放乙酰胆碱,进而抑制巨噬细胞等免疫细胞释放炎症相关因子,最终达到控制炎症的目的。内毒素血症（endotoxemia, ETM）由内毒素激活免疫细胞释放炎症因子而引起,常用于制作系统性炎症模型和研究胆碱能抗炎通路的机理。迷走神经耳支是迷走神经在体表的唯一分支,主要分布在耳廓的耳甲区（耳甲艇和耳甲腔）,与孤束核、迷走神经背核、迷走神经之间有密切联系。耳迷走神经投射到孤束核、迷走神经背核及疑核等神经中枢,是耳-迷走神经反射弧的重要组成部分。耳甲区迷走神经末梢与孤束核、迷走神经背核有直接投射关系。针刺耳甲区能激活孤束核和迷走神经背核神经元放电。而胆碱能抗炎通路的初级传入中枢是孤束核,并且通过迷走神经背核发出迷走神经传出冲动。因此,我们设想耳针刺激能够通过激活耳甲区传入性迷走神经进而促使传出性迷走神经传出冲动增加,从而激活胆碱能抗炎通路,最终抑制炎症反应。本研究从系统性炎症因子、NF-κB通路、组织器官炎症因子表达及器官病理状况等层面研究耳针刺激对炎症发生发展的调节作用,探讨耳针激活胆碱能抗炎通路的作用机制。1.耳针对内毒素血症大鼠血清细胞因子的影响雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠,体重280-300g,中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供,许可证号：SCXK-（军） 2007-004。动物自由摄食和饮水。所有大鼠腹腔注射10%乌拉坦（1mL/100g）麻醉。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS. Escherichia coli 0111:B4;Sigma）用生理盐水配制10mg/mL溶液,参照有关文献造模方法,相关各组动物经尾静脉注射脂多糖（10mg/mL,0.5mL/kg）。通过检测血清炎症因子水平、观察肺脏组织病理图片判断大鼠内毒素血症模型制作成功。其余组别经尾静脉注射等量生理盐水。1.1实验一（静脉给药2h）实验分组A组正常对照组（n=12）：经尾静脉注射等量生理盐水。B组模型组（n=12）：经尾静脉注射脂多糖,造模2h后取材。C组单纯耳甲迷走神经电针组（简称单纯耳甲电针组,n=12）：经尾静脉注射等量生理盐水,1.5h后进行双侧耳甲刺激,造模2h后取材。D组耳甲迷走神经电针组（简称耳甲电针组,n=12）：经尾静脉注射脂多糖,1.5h后进行双侧耳甲刺激,造模2h后取材。E组迷走神经刺激组（n=12）：经尾静脉注射脂多糖,1.5h后进行左侧颈部迷走神经干刺激,造模2h后取材。F组“后三里”电针组（简称“后三里”组,n=12）：经尾静脉注射脂多糖,1.5h后进行双侧“后三里”刺激,造模2h后取材。ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10。实验结果与正常对照组相比,模型组TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10水平明显升高（P<0.01）；与模型组相比,耳甲电针组和迷走神经刺激组TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10水平明显下降（P<0.01）；“后三里”组‘TNF-α、IL-10水平明显下降（P<0.05,P<0.01）。与迷走神经刺激组相比,耳甲电针组IL-6、IL-1β及IL-10水平有显著差异（P<0.05,P<0.01）,“后三里”组TNF-α水平、IL-6水平、IL-1β及IL-10水平有显著差异（P<0.05,P<0.01）。1.2实验二（静脉给药4h）1.2.1实验分组G组正常对照组（n=12）：经尾静脉注射等量生理盐水,给药4h后取材。H组模型组（n=13）：经尾静脉注射脂多糖,造模4h后取材。I组耳甲迷走神经电针组（简称耳甲电针组,n=14）：经尾静脉注射脂多糖,1.5h后进行双侧耳甲刺激,造模4h后取材。J组“后三里”电针组（简称“后三里”组,n=13）：经尾静脉注射脂多糖,1.5h后进行双侧“后三里”刺激,造模4h后取材。1.2.2指标检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10浓度检测采用酶联免疫法,ELISA试剂盒由美国R&D公司提供,检测方法严格按照试剂盒说明书进行。1.2.3实验结果与正常对照组相比,模型组TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10水平明显升高（P<0.01）：与模型组相比,耳甲电针组TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显下降（P<0.05）；“后三里”组IL-1β水平明显下降（P<0.05）。13实验三（静脉给药6h）1.3.1实验分组K组正常对照组（n=11）：经尾静脉注射等量生理盐水,给药6h后取材。L组模型组（n=10）：经尾静脉注射脂多糖,造模6h后取材。M组耳甲迷走神经电针组（简称耳甲电针组,n=11）：经尾静脉注射脂多糖,1.5h后进行双侧耳甲刺激,造模6h后取材。N组“后三里”电针组（简称“后三里”组,n=10）：经尾静脉注射脂多糖,1.5h后进行双侧“后三里”刺激,造模6h后取材。1.3.2指标检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10浓度检测采用酶联免疫法,ELISA试剂盒由美国R&D公司提供,检测方法严格按照试剂盒说明书进行。1.3.3实验结果与正常对照组相比,模型组TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显升高（P<0.05,P<0.01）；与模型组相比,耳甲电针组IL-6、IL-1β水平明显下降（P<0.05）,IL-10水平明显上升（P<0.05）；“后三里”组TNF-α、IL-1β水平明显下降（P<0.05）。1.4实验四（迷走神经阻断）1.4.1实验分组A组正常对照组（n=11）：经尾静脉注射等量生理盐水。B组模型组（n=10）：经尾静脉注射脂多糖。O组迷走神经切断+耳甲迷走神经电针组（简称迷切耳针组,n=11）：经尾静脉注射脂多糖后立即切断双侧颈部迷走神经干,1.5h后进行双侧耳甲刺激。P组迷走神经切断+“后三里”电针组（简称迷切“后三里”组,n=10）：经尾静脉注射脂多糖后立即切断双侧颈部迷走神经干,1.5h后进行双侧“后三里”刺激。Q组N受体拮抗+耳甲迷走神经电针组（简称N受体拮抗耳针组,n=10）：造模前经右侧颈静脉注射六烃季铵（10mg/kg）,造模1.5h后进行双侧耳甲刺激。R组N受体拮抗+“后三里”电针组（简称N受体拮抗“后三里”组,n=10）：造模前经右侧颈静脉注射六烃季铵（10mg/kg）,造模1.5h后进行双侧“后三里”刺激。S组N受体α-7亚单位拮抗+耳甲迷走神经电针组（简称α-BGT耳针组,n=10）：造模前经右侧颈静脉注射α-银环蛇毒素（1μg/kg）,造模1.5h后进行双侧耳甲刺激。T组N受体α-7亚单位拮抗+“后三里”电针组（简称α-BGT’后三里”组,n=10）：造模前经右侧颈静脉注射α-银环蛇毒素（1μg/kg）,造模1.5h后进行双侧“后三里”刺激。1.4.2指标检测血清TNF-α采用酶联免疫法,ELISA试剂盒由美国R&D公司提供,检测方法严格按照试剂盒说明书进行。1.4.3实验结果与正常对照组相比,模型组TNF-α水平明显升高（P<0.01）；与模型组相比,O、P、Q、R、S及T组TNF-a水平无限制差异。2.耳针对NF-κB通路的影响2.1肺组织NF-κB p65蛋白表达变化2.1.1实验一（静脉给药2h）采用第一部分实验一中A、B、C、D、E及F组的肺组织样本（在-80℃超低温冰箱保存的肺右叶组织）。采用蛋白免疫印记法（Western Blot）测定各组肺脏组织NF-κB p65蛋白表达。实验结果：与正常对照组（A组）相比,模型组（B组）NF-κB表达明显上调（P<0.01）；与模型组相比,耳甲电针组（D组）及迷走神经刺激组（E组）NF-κB表达明显下调（P<0.01）；与耳甲电针组相比,“后三里”组（F组）NF-κB表达明显增加（P<0.05）：与迷走神经刺激组相比,“后三里”组NF-κB表达明显上调（P<0.01）。2.1.2实验二（静脉给药4h）采用第一部分实验二中G、H、I及J组的肺组织样本（在-80。C超低温冰箱保存的肺右叶组织）。采用蛋白免疫印记法（Western Blot）测定各组肺脏组织NF-κB p65蛋白表达。实验结果：与正常对照组（G组）相比,模型组（H组）NF-κB表达明显上调（P<0.01）；与模型组相比,耳甲电针组（I组）NF-κB表达明显下调（P<0.05）。2.1.3实验三（静脉给药6h）采用第一部分实验三中K、L、M及N组的肺组织样本（在-80℃超低温冰箱保存的肺右叶组织）。采用蛋白免疫印记法（Western Blot）测定各组肺脏组织NF-κB p65蛋白表达。实验结果：与正常对照组（K组）相比,模型组（L组）NF-κB表达明显上调（P<0.01）：与模型组相比,耳甲电针组（M组）NF-κB表达明显下调（P<0.01）。2.2肺脏NF-κB p65活性变化2.2.1实验一（静脉给药2h）采用第一部分动物实验一中的A、B、D、E及F组中用甲醛固定的肺组织。采用免疫组化法测定各组肺脏组织NF-κB p65蛋白表达。实验结果：与正常对照组（A组）相比,模型组（B组）NF-κB p65表达明显上调（P<0.01）；与模型组相比,耳甲电针组（D组）、迷走神经刺激组（E组）NF-κB p65表达明显下调（P<0.01）；与迷走神经刺激组相比,“后三里”组（F组）NF-κB p65表达明显升高（P<0.05）。2.2.2实验二（静脉给药4h）采用第一部分实验一中的G、H、I及J组中用甲醛固定的肺组织。采用免疫组化法测定各组肺脏组织NF-κB p65蛋白表达。实验结果：与正常对照组（G组）相比,模型组（H组）NF-κB p65表达明显上调（P<0.01）；与模型组相比,耳甲电针组（I组）、“后三里”组（J组）NF-κB p65表达明显下调（P<0.01,P<0.05）2.2.3实验三（静脉给药6h）采用第一部分实验一中的K、L、M及N组中用甲醛固定的肺组织。采用免疫组化法测定各组肺脏组织NF-κB p65蛋白表达。实验结果：与正常对照组（K组）相比,模型组（L组）NF-κB p65表达明显上调（P<0.01）；与模型组相比,耳甲电针组（M组）、“后三里”组（N组）NF-κB p65表达明显下调（P<0.05）。2.2.4实验四（迷走神经阻断）采用第一部分实验一中的A、B组及实验四中的O、P组用甲醛固定的肺组织。采用免疫组化法测定各组肺脏组织NF-κB p65蛋白表达。实验结果：与正常对照组（A组）相比,模型组（B组）NF-κB p65表达明显上调（P<0.01）；与模型组相比,迷切耳针组（O组）、迷切“后三里”组（P组）NF-κB p65表达无明显变化。3.耳针对内毒素血症大鼠器官组织影响3.1肝脏组织TNF-αmRNA、IL-10 mRNA表达3.1.1实验一（静脉给药2h）采用第一部分动物实验一中A、B、D、E及F组的肝脏组织样本（在-80℃超低温冰箱保存的肝左外叶组织）。采用定量PCR法测定各组肝脏组织TNF-αmRNA表达变化。实验结果：与正常对照组（A组）相比,模型组（B组）TNF-αmRNA表达明显增加（P<0.01）：与模型组相比,耳甲电针组（D组）、迷走神经刺激组（E组）TNF-αmRNA表达明显减少（P<0.05,P<0.01）。3.1.2实验二（静脉给药4h）采用第一部分动物实验二中G、H、I及J组的肝脏组织样本（在-80℃超低温冰箱保存的肝左外叶组织）。采用定量PCR法测定各组肝脏组织。TNF-αmRNA、IL-10 mRNA表达变化。实验结果：与正常对照组（G组）相比,模型组（H组）TNF-αmRNA表达明显增加（P<0.01）：与模型组相比,耳甲电针组（I组）、“后三里”组（J组）TNF-αmRNA表达明显减少（P<0.01）。与正常对照组（G组）相比,模型组（H组）IL-10 mRNA表达明显增加（P<0.01）；与模型组相比,耳甲电针组（I组）、“后三里”组（J组）IL-10 mRNA表达明显增加（P<0.01,P<0.05）。3.1.3实验三（静脉给药6h）采用第一部分动物实验二中K、L、M及N组的肝脏组织样本（在-80℃超低温冰箱保存的肝左外叶组织）。采用定量PCR法测定各组肝脏组织TNF-αmRNA、IL-10mRNA表达变化。实验结果：各组动物肝TNF-α、IL-10 mRNA表达变化见表X、图X。与正常对照组（K组）相比,模型组（L组）TNF-αmRNA表达明显增加（P<0.01）：与模型组相比,耳甲电针组（M组）、“后三里”组（N组）TNF-αmRNA表达明显减少（P<0.01,P<0.05）。与正常对照组（K组）相比,模型组（L组）IL-10 mRNA表达明显增加（P<0.01）；与模型组相比,耳甲电针组（M组）、“后三里”组（N组）IL-10 mRNA表达明显增加（P<0.05）。3.2肺组织病理学变化采用第一部分动物实验一中的A、B、D、E及F组中用甲醛固定的肺组织。采用常规苏木素-伊红（HE）染色法观察各组肺脏组织病理变化。实验结果：正常对照组（A组）肺泡结构完整,无萎陷,未见出血及炎细胞渗出。模型组（B组）肺泡结构破坏,可见萎陷、不张,肺泡腔内见大量红细胞及渗出液,支气管结构紊乱。耳甲电针组（D组）和迷走神经刺激组（E组）较之模型组损伤程度减轻,肺泡结构破坏明显减少。“后三里”组（F组）较之模型组损伤程度略减轻。4.结论本研究从血液循环细胞因子水平、NF-κB亘路、内脏器官细胞因子mRNA水平及器官组织病理变化等几个层面阐述了耳针抑制内毒素血症大鼠炎症发展的效应机制。通过造模后不同时间点炎症因子浓度变化揭示内毒素血症的发展变化过程。同时通过不同时间点相应指标的变化,观察耳针在炎症过程中的干预作用。实验结果表明：耳针对各时间点的致炎因子都有明显的抑制作用,其效应与直接刺激迷走神经相似,在进行迷走神经阻断后,耳针的抗炎效应消失。同时,耳针抑制了各时间点NF-κB p65的表达,但是这种抑制作用同样有赖于迷走神经的完整。以上结果说明耳针抑制血液循环炎症因子及NF-κB通路可能是通过激活胆碱能抗炎通路来实现的。耳针刺激还有助于肝脏致炎因子TNF-amRNA水平的降低及抗炎因子IL-10mRNA水平的升高,这可能是抑制器官炎症发展的关键环节。此外,耳针刺激改善了肺脏组织的病理状态,说明其对内毒素血症中的器官具有保护作用。以上这些结果为耳针激活胆碱能抗炎通路治疗炎症提供了理论依据。本研究还进行了直接刺激迷走神经、耳针刺激和“后三里”刺激三种刺激方法抗炎效应的比较。结果发现：直接刺激迷走神经效果优于耳针刺激和“后三里”刺激,耳针刺激效果优于“后三里”刺激。这可能是由于同“后三里”刺激相比,迷走神经刺激和耳针刺激更为直接地激活了胆碱能抗炎通路。
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